重组蛋白的高产量瞬时表达

图a. 用ELISA法测得培养液中IgG的含量；横轴为天数，纵轴为IgG滴度。

采用高密度瞬时转染（High-density transfection）的方法，可以在HEK-293 EBNA1细胞中大量表达重组蛋白。实验表明，该方法具有操作简单，培养周期短，转染效率高，批次产量高的优点。

重组蛋白具有极高的经济价值和科研价值，但是在哺乳动物细胞中使用稳定转染方法将会消耗大量的时间，而传统的瞬时转染方法，在产量上也难以令人满意。本文介绍的高密度悬浮瞬时转染的表达方法（Large-scale transient gene expression，TGE）可在较短的时间内大量生产重组蛋白，是一种降低生产强度和节省成本的新方法。

实验部分

细胞株及主要试剂

HEK-293 EBNA1细胞株（ATCC）；Polyethylenemine（Polysciences, pH7）；Ex-Cell 293培养基（SAFC, 4mM L-glutamine）；Pluronic F68（Sigma-Aldrich）；质粒pEGFP-N1；pEAK8-LH39；pEAK8-LH41。

实验仪器及耗材

二氧化碳恒温摇床（Infors）；转瓶机（IBS）；荧光显微镜（Olympus）；生物安全柜（ESCO）；细胞摇瓶（Nalgene）；细胞培养板（Jet）；移液器（Eppendorf）；电动移液枪（IBS）；移液管（Jet）；低速离心机（Sysbery）等。以上仪器和试剂均从上海西域一站式采购而得。

实验方法

将HEK-293 EBNA1细胞以3×105个/ml的密度接种于Ex-Cell 293培养基中，放置于100rpm摇瓶或75rpm转瓶中在37℃、5%CO2的环境下培养3天，当细胞密度增为1.5~2×106个/ml，细胞活力大于95%的情况下进行后续的转染工作。

在无菌环境下取出所有细胞液，以1000rpm的转速离心5min，弃去所有培养上清并用新鲜的Ex-Cell 293培养基重悬细胞沉淀，同时调整细胞密度为20×106个/ml，将高密度的细胞悬液置于6孔板或小摇瓶中保持低速振荡状态以免细胞抱团。

图b. 用苔盼蓝染色法得到的细胞密度及细胞活力；横轴为天数，左纵轴为细胞密度，右纵轴为细胞活力。

缓慢向细胞液中滴加待转质粒，用量为50μg/ml；质粒滴加完毕后，同样缓慢滴加PEI，用量为100μg/ml，将高浓度的转染细胞液置于摇瓶或转瓶中振荡孵育4h。请注意质粒与PEI的滴加次序，如果顺序倒置则会降低转染效率。

孵育完毕后，使用Ex-Cell 293培养基稀释转染细胞的密度至1×106个/ml，再加入1%的Pluronic F68完成整个转染过程。将细胞悬液置于37℃、5%CO2摇瓶或转瓶的环境中培养5天即可收液。

分别进行单转pEGFP-N1的实验组和共转pEAK8-LH39+pEAK8-LH41（3:7）的实验组来考察该方法的转染效率及表达情况。

结果

转染完毕2天后，细胞密度约为9.3×105个/ml，通过荧光显微镜观测单转pEGFP-N1质粒细胞组的荧光率，转染效率约为70%，细胞活力约为88%；培养五天后，细胞密度降为7.3×105个/ml，细胞活力跌至约30%，但共转质粒组的细胞液中将得到最大的重组蛋白含量，约为25mg/l。

结论

实验结果表明，本文的高密度瞬时转染方法具有操作简单，培养周期短，转染效率高，批次产量高的优点；另有文献表明，适当降低转染后的细胞培养温度至31℃，能提供更高的重组蛋白产量。该实验方法可以满足生产企业及科研机构在短期内大量生产重组蛋白的需求，并为实验单位节省了劳动力开支及耗材成本。