重组DNA分子的转化实验原理和实验步骤（一）

1实验原理

DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。对于不同的受体细胞，往往采取不同的转化战略。

1.1 DNA重组分子的常用转化方法

1.1.1 Ca 2 诱导转化

1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收l噬菌体DNA，此后不久，Cohen等人用此法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序为：1）将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2 低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2 使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2）此时加入DNA，Ca 2 又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；3）经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg 2 的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2 与CaCl2 又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，Hanahan除了用CaCl2 和MgCl2 处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca 2 诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。

1.1.2 PEG介导的细菌原生质体转化

在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子的吸收。此时，再加入含有待转化的DNA样品和聚乙二醇的等渗溶液，均匀混合。通过离心除去聚乙二醇，将菌体涂布在特殊的固体培养基上，再生细胞壁，最终得到转化细胞。这种方法不仅适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性细菌，也对酵母菌、霉菌甚至植物等真核细胞有效。只是不同种属的生物细胞，其原生质体的制备与再生的方法不同。

1.1.3电穿孔驱动的完整细胞转化

电穿孔（Electroporation）是一种电场介导的细胞膜可渗透化处理技术。受体细胞在电场脉冲的作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得 DNA分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。具体操作程序因转化细胞的种属而异。对于大肠杆菌来说，大约50ml的细菌与DNA样品混合后，置于装有电极的槽内，然后选用大约25微法拉第、2.5千伏和200欧姆的电场强度处理4.6毫秒，即可获得理想的转化效率。虽然电穿孔法转化较大的重组质粒（＞100Kb）的转化效率比小质粒（～3Kb）低一千倍，但这比Ca2 诱导和原生质体转化方法理想，因为这两种方法几乎不能转化大于100Kb的质粒DNA。对于几乎所有的细菌均可找到一套与之匹配的电穿孔操作条件，因此电穿孔转化方法有可能成为细菌转化的标准程序。