重组M13噬菌体克隆分析

重组 M13 噬菌体单链 DNA M13 噬菌体重组噬菌斑 M13 噬菌体非重组载体噬菌斑 大肠杆菌 F' 菌株

SDS SSC 蔗糖凝胶加样缓冲液

琼脂糖凝胶 水浴

一、材料

1. 缓冲液和溶液

SDS ( 2%, m/V)

20 X SSC

蔗糖凝胶加样缓冲液

2. 凝胶

琼脂糖凝胶（0.7%）悬于 0.5 X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

3. 核酸和寡核苷酸

重组 M13 噬菌体单链 DNA

4. 专用设备

水浴，调至 65℃

5. 载体和菌株

在上层琼脂糖中的 M13 噬菌体重组噬菌斑

在上层琼脂糖中，分离良好的 M13 噬菌体非重组载体噬菌斑

大肠杆菌 F' 菌株

二、方法

1. 取单个噬菌斑，按方案“M13 噬菌体液体培养”的方法，在适当 F' 宿主中生长，制备推定的重组噬菌体的原种。

2. 用带有无菌吸头的微量移液器从每个上清中各取 20 μl 至一新微量离心管，剩余上清 4℃ 保存，备用。

3. 在每个 20 μl 上清中各加入 1 μl 2% SDS, 轻拍管壁混合内容物，65℃ 温育 5 min。

4. 在各管中加入 5 μl 蔗糖加样缓冲液，再轻拍混合内容物，用 0.7% 琼脂糖凝胶电泳分析，在 5 V/cm 条件下电泳，用已鉴定的带有已知大小外源序列的 M13 重组体单链 DNA 作为阳性对照。

5. 溴酚蓝迁移至胶末端后，在紫外线下照相。

6. 比较推定重组体释放的单链 DNA 与那些作为对照的非重组噬菌体释放的 DNA 的电泳迁移率。

7. 如果需要，可将凝胶上的单链 DNA 转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜，并用适当的放射性标记探针杂交，以确证外源 DNA 的存在。凝胶先用 10 倍体积的 20 X SSC 浸泡 45 min, 然后直接将 DNA 转移至膜上。