野生型杆状病毒的纯化实验

杆状病毒

TE 蛋白酶K N-十二烷基肌氨酸 苯酚 氯仿 异戊醇 乙醇 乙酸钠

培养瓶 锥形瓶 转子 离心机 聚苯乙烯管

1.  以每1.8x10⁷细胞的密度接种Sf9细胞于至少10个150 cm² 培养瓶中。27℃温育约2 h，让细胞牢固贴壁，以0.1的感染复数用野生型AcMNPV感染。当观察到多数细胞中含有包涵体时，将病毒上清（约200 ml）转移至4个50 ml 锥形管中。

2.  4℃ 1 000 g 离心10 min，将病毒上清倒入4个新的管子中。重复离心以去除所有残留细胞。

3.  将病毒上清置于SW-27超离心管中，平衡后于4℃，100 000 g 离心30 min，收集病毒。倾倒出上清，将管子倒扣于Kimwipe纸巾上，尽可能倒干液体。

4.  仔细检査病毒沉淀块，如果病毒沉淀较纯（应该是不透明、发白的外观），则转至步骤10继续进行。多数情况下，病毒沉淀块由于有细胞碎片的存在而会发黄。如果是这种情况，则用下列两种方法中的一种从细胞残序物中分离出病毒。

用蔗糖梯度分离纯化病毒团块：

5a.  加入1 ml 0.1xTE缓冲液，反复上下吹打重悬病毒沉淀。如果沉淀难以重悬，则于4℃温育过夜。

6a.  用溶于0.1 xTE缓冲液中经过滤除菌的超纯蔗糖制备两份从25%到56%蔗糖线性梯度液，置于超离心管中。

7a.  仔细将0.5 ml 病毒悬液铺至每一蔗糖梯度液的顶部，4℃ 100 000 g 离心90 min。

8a.  用巴斯德吸管将病毒带转移至SW-41超离心管中，管的上部加入0.1xTE缓冲液。

9a.  于4℃ 100 000 g 离心30 min，收集病毒，弃上清，倒扣离心管于Kimwipe纸巾上，尽 可能倒干液体。

微量离心纯化病毒沉淀块：

5b.  加入3 ml 抽提缓冲液，反复上下吹打重悬病毒沉淀。如果难以重悬，则于4℃温育过夜。

6b.  分别转移1.5 ml 病毒悬液于两个1.5 ml 微量离心管中。最大速度下微量离心5 min，上清转移至一个15 ml 聚苯乙烯离心管中。

7b.  用1 ml 抽提缓冲液重悬每一团块，冼涤。

8b.  在最大速度下微量离心5 min，将两份上清与15 ml 聚丙烯管中的上清液合并。

9b.  用抽提缓冲液补足至9 ml，分成4.5 ml 的两小份移至2个15 ml 聚丙烯离心管中。转至步骤11继续。

10.  用9 ml 抽提缓冲液重悬沉淀，分成4.5 ml 的两小份移至2个15 ml 聚丙烯离心管中。

11.  每管分别加入200 ug 10 mg/ml 蛋白酶K，50℃保温1~2 h。

12.  每管各加入0.5 ml 10%N-十二烷基肌氨酸钠，50℃温育2 h或过夜。

13.  用等体积的25：24 ： 1的酚/氯仿/异戊醇抽提DNA两次。

14.  用一宽嘴（5~10 ml）吸管将含有DNA的水相转移至另一个15 ml 聚丙烯管中。加10 ml 100%的乙醇，倒转离心管数次，轻柔混合，于-80℃放置10 min。

15.  于4℃，1 500 g 在台式离心机中离心20 min，弃上清，以70%乙醇洗涤DNA沉淀，风干30~60 min。加入800 ul 1xTE缓冲液重悬沉淀。 

16.  各取400 ul 移至两个微量离心管中，每管中加入40 ul 3.0 mol/l 乙酸钠和2倍体积的100%乙醇重新沉淀DNA放置10 min。

17.  微量离心10 min。弃上清。用70%乙醇洗涤DNA沉淀并冻干，用0.3~1 ml 1xTE缓冲液重悬DNA。测260 nm 吸光值并计算产量。DNA保存于4℃。