金属螯合亲和层析实验

蛋白质

IPTG NiSO4 蛋白酶抑制剂 MCAC-EDTA Triton

层析柱 转子

1.  接种含以pET载体表达带组氨酸尾融合蛋白的大肠扦菌BL21（DE3）pLyaS菌株于10 ml M9ZB/氨苄青霉素/氯霉素培养基。于37℃摇荡培养过夜。

2.  转接1 ml 过夜培养物于100 ml M9ZB/氨苄青霉索/氯霉素培养基，于37℃揺荡培 养至OD₆₀₀=0.7~1.0。

3.  加入1 ml 0.1 mol/l IPTG，干37℃继续培养1~3 h。

4.  4 400 g 离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-70℃。
 

往一根1.5 cm×10 cm 层析柱中加入1 ml NTA介质，让液体刚好流至柱床的顶部， 用下列液体洗柱：

0.5 ml （3个床体积）去离子水

0.5 ml （5个床体积）50 mmol/l NiSO₄·6H₂O

0.5 ml MCAC-0缓冲液
 

6.  将菌体沉淀置于冰浴中冻融，加入5 ml MCAC-0缓冲液和33 μl 150×蛋白酶抑制剂混合液。用吸管吹打重悬，超声破菌或匀浆。

7.  加入0.05 ml 10%（w/v）Triton X-100溶液（至终浓度0.1%）充分混匀，在 -70℃冻结 10 min。

8.  在冰浴中冻融细胞悬液。于260 000 g 离心60 min，将上清吸至在冰浴中的干净容器，弃沉淀。取10 μl 小份样品冻结于-70℃，留待以后分析之用

9.   如果提取液被冻结，在冰上冻融，以10~15 ml/h 的流速上Ni²⁺-NTA柱。收集流出液，保留待进行SDS-PAGE分析。

10.  以20~30 ml/h 的流速用5 ml MCAC-0缓冲液洗柱，弃流出液。

11.  以分段冼脱的方式分别依次用5 ml 下列缓冲液冼柱：MCAC-20、MCAC-40、MCAC-60、MCAC-80、MCAC-100、MCAC-200、MCAC-1000。分部收集每1 ml 洗脱液，保留待SDS-PAGE分析。

12.  在10~15 ml/h 的流速下以5 ml MCAC-EDTA缓冲液洗柱，收集毎1 ml 级分。

13.  分析各级分中所含的冼脱蛋白。

14.  合并含洗脱蛋白质的级分，取出10 μl 用SDS-PAGE分析。必要时，透析除去MCAC缓冲液。将样品分成小份，在-70℃或液氮中冻结。