金属螯合层析(metalchelatechromatography)分离纯化超氧化物歧

[原理]
金属螯合层析是利用固定相偶联的配基——亚氨基二乙酸(IDA)及金属离子发生螯合作用，该金属离子又与蛋白分子中的某些含有巯基或咪唑基的氨基酸结合。
金属螯合层析主要分为3个阶段：第一阶段是螯合介质与二价金属离子作用生成金属螯合介质；第二阶段是在一定的条件下金属螯合介质与被分离蛋白质分子形成金属螯合复合物；第三阶段是从金属螯合介质上将被分离物质解吸下来。
本实验采用亚氨基二乙酸(IDA)以二纳盐形式与环氧化的琼脂糖-6B结合，再在偏碱性的条件下与二价金属铜离子发生可逆性螯合，二价金属铜离子又与含有咪唑基的超氧化物歧化酶发生可逆性的螯合吸附。金属离子在螯合介质与被分离分子之间起着桥梁作用，金属离子的一端与螯合介质连接，另一端与被分离组分结合。这两种结合方式都是可逆的，在一定条件下洗脱被分离组分。

[试剂和器材]
1、试剂
（1）琼脂糖
（2）亚氨基二乙酸（IDA）
（3）环氧氯丙烷
（4）三羟甲基氨基甲烷（Tris）
（5）氢氧化钠
（6）氯化钠
（7）硼氢化钠
（8）pH10.0、2mol/LNa2CO3 -NaHCO3缓冲液
（9）pH7.2、20mmol/L磷酸缓冲液

2、器材
（1）层析柱
（2）紫外分光光度计
（3）部分收集器
（4）沸水浴
（5）金属网筛

[方法和步骤]
1、 IDA-琼脂糖6B的制备
称取琼脂糖2g，加入蒸馏水30mL，沸水浴充分溶解，待冷却结块后，过20~30目筛，称重，每克湿重加入 1mol/L NaOH（含0.2%NaBH4）1mL，然后在30℃水浴中搅拌下加入1/10倍上述氢氧化钠体积的环氧氯丙烷。水浴温度缓慢升至 60℃，保温继续反应2h，趁热过滤并用预热的蒸馏水洗涤至近中性。
10g上述凝胶中加入50mL含2g IDA的pH10.0、 2mol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液，于60~65℃水浴中搅拌24h，其间分次加入20 mL含3g IDA的碳酸盐缓冲液。反应产物用2L水、10%乙酸0.5L、2L水依次洗涤。

2、柱制备
按常规将IDA-琼脂糖6B装柱（1.5cm×20cm），用10mmol/LCuSO4流过层析柱，螯合铜离子，制备成亲和层析柱。

3、 SOD亲和层析
亲和层析柱用20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.2，含0.5mol/LNaCl）平衡，含SOD 的粗制品上柱后，依次用 20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.2，含0.5mol/LNaCl）、20mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0，含0.8mol/LNaCl）、 20mmol/L磷酸缓冲液[pH7.8，含0.5mol/L(NH4)2SO4] 洗脱。收集SOD活性峰，测定酶活性和蛋白质浓度。

[结果与计算]
计算金属螯合层析前后样品和收集峰的酶比活、纯化倍数、酶活性回收率和蛋白质回收率。