金黄色葡萄球菌的实验室检测方法

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。而对于金黄色葡萄球菌在速冻食品中的存在量，卫生部于2011年11月24日公布食品安全国家标准《速冻面米制品》，允许金葡菌限量存在。今天我们主要来了解一下它的检测方法。

一、材料与方法

1、材料

①培养基：7.5%NaCl肉汤培养基，血琼脂平板培养基（按常规方法制作）

②试剂：7.5%NaCl肉汤培养基，革兰氏染色，血琼脂平板，Baird-Parker琼脂平板，生理盐水，兔血浆（1：4）

③器材：温箱，显微镜，天平，均质器，载玻片，L型涂片棒，三角瓶，刻度吸管，平皿，试管及试管架，研磨，1ml注射器，

④实验动物：健康的小白鼠

2、方法

待检样品25g+225ml 灭菌生理盐水
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　　直接计数法 增菌培养方法
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　　Baird-Parker琼脂平板 7.5%NaCl肉汤培养基
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　　血平板 血平板
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　　涂片染色镜 溶血观察　动物接种试验 血浆凝固试验
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　　报告

二、实验步骤

1、样品的采集

称取25g火腿肠，切碎搅匀（用灭菌研钵研磨），置于250ml 锥形瓶中，加入225ml 灭菌生理盐水，制成1：10样品混悬液，混匀后作用20分钟，随机取10ml 离心。

2、增菌及分离培养

①增菌培养方法：吸取5ml上清液，接种于7.5%NaCl肉汤培养基内，置于（37±1℃）恒温箱中培养24h，划线接种入血平板，（37±1℃）恒温箱中培养24h。

②直接计数方法：吸取上述悬液，进行10倍递增稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液各1ml，分别加入3个Baird-Parker琼脂平板，每个平板的接种量分别为0.3ml、0.3ml、0.4ml。用灭菌L型涂布棒涂布整个平板，置于（37±1℃）恒温箱中培养24h。之后分别对3个平板上生长的周围有浑浊带的黑色菌落进行计数。转接入血平板，（37±1℃）恒温箱中培养24h。

3、涂片、染色与镜检

将纯培养的未知菌涂片，革兰氏染色，显微镜观察。

4、生化实验

①触酶试验

在载玻片上滴1滴3%的过氧化氢，调取纯化的细菌放在过氧化氢中观察变化。30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。

②血浆凝固酶试验

吸取1：4新鲜兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入培养24h的2①中的肉汤培养液0.5ml，摇荡均匀，放入（37±1℃）恒温箱中培养，每0.5h观察一次，观察6h，检查是否出现凝固。将试管倾斜或倒置时，呈现凝块状，可判定为阳性，同时以已知阳性葡糖球菌和阴性肉汤作为对照。

5、动物感染实验

用无菌生理盐水将2①中血琼脂板上纯化的菌落洗下后，以0.5ml/只腹腔注射入小白鼠体内，同时用灭菌生理盐水注射入另外的小白鼠体内，以做对照，分别在相同条件饲养，观察其症状。对感染试验出现症状或死亡的小白鼠进行剖检，并采集病料，进行分离。

三、结果与分析

1、培养特性及形态特征

①培养特性

在37℃条件下，需氧与厌氧培养的血液营养琼脂平板均长出光滑、湿润、隆起，约1mm大小的金黄色菌落，并且有β溶血现象。

②镜检结果

显微镜下观察该菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄串状，也有个别2个或3个球菌相连。根据菌落形态、镜检结果怀疑该菌为葡萄球菌。

2、菌落计数报告

将直接计数法试验中的3个平板中疑似黑色葡萄球菌的金黄色菌落数相加，乘以血浆凝固酶试验阳性数，除以5，在乘以稀释倍数，即为每克样品中金黄色葡萄球菌数量。

3、动物感染试验

只注生理盐水的小白鼠没有任何变化：接种分离菌的小白鼠在9h内死亡。将死亡的小白鼠剖检采集病料，进行细菌分离和生化试验，得到与原分离菌。

“金球菌”列为“极重要质量项目”

金黄色葡萄球菌因思念、三全、湾仔码头事件而引发标准争议，在2011年12月21日实施的速冻食品新国标中，金黄色葡萄球菌从原来“不得检出”变为“限量检出”，但这一检测标准的改变并不代表可以忽略金黄色葡萄球菌的危害性。

在市质监局征集意见而公示的抽检项目中查询到，对包括速冻水饺、汤圆、包子、花卷、馒头、南瓜饼、八宝饭等在内的速冻米面食品，仍然计划把金黄色葡萄球菌列入A类检验项目，并标注为“极重要质量项目”，同时速冻米面食品的沙门氏菌也是A类检验。

速冻食品“金球菌”可限量检出

中国现行《速冻预包装面米食品卫生标准》（GB19295－2003）规定金黄色葡萄球菌等致病菌不得检出。
而卫生部于2012年12月21日实施的《速冻面米制品食品安全国家标准》，将金黄色葡萄球菌检测由定性转向定量，规定每批产品抽检5个样品中，至多只能有1个样品每克生制品中检出的金黄色葡萄球菌含量在1000至10000个之间。