钙调蛋白样品的测活实验

MLCK 的底物肽 ATP 钙调蛋白储液 MLCK 酶 磷酸 丙酮（任选） MLCK 测活缓冲液

聚丙烯微量离心管 Whatman*P81 磷酸纤维素纸（切成条) 玻璃烧杯 加样器 闪烁瓶 闪烁计数器 吹干机（任选)

材料与设备

聚丙烯微量离心管 (1.5-ml)

MLCK 的底物肽（10mmol/L 浓缩储液；测活时，用水按 1：20 稀释成 0.5 mmol/L溶液)

ATP（2 mmol/L 储液，含 5μCi 的 [γ-³²P]ATP/5ul)

钙调蛋白储液 (0.1ug/ml 或 1ug/ml)

MLCK 酶（浓缩储液保存于-70°C; 测活时，用 1mg/ml 牛血清白蛋白按 1:200稀释）

水浴

Whatman*P81 磷酸纤维素纸（切成条)

磷酸（75 mmol/L)(3X4L)

玻璃烧杯（3~4L 容积)

加样器（3~10-ml)

闪烁瓶

闪烁计数器

丙酮（任选）

吹干机（任选)

试剂

MLCK 测活缓冲液（10x)

(配方，见“试剂的配制”，PP.82~83)

操作程序

1) 对每次测活，将下列试剂置于一 1.5-ml 聚丙烯微量离心管中:

MLCK 测活缓冲液 (10x)                                                                5ul

MLCK 的底物肽 (0.5 mmol/L)                                                        5ul

[γ-³²P]ATP(2 mmol/L 35uCi/5ul)                                                    5ul

钙调蛋白（0.1ug/ml 或 1ug/ml) 或各步纯化所得的未知样品         0~20ul

Milli-Q 水                                                                                        10~30ul

MLCK 酶 (储液按 1:200 稀释)                                                         5ul

总体积                                                                                             50ul

注：各步纯化所得的组分, 若含 EDTA 或 EGTA, 则应制成过量的 1mmol/LCaCl₂ 溶液。每个组分应测几个稀释度，如 1:10、1:100 和 1:1000。在上述条件下，钙调蛋白的半数有效剂置约为 4ng。MLCK 试验的钙调蛋白 (0.2~20ng) 标准曲线，见图 1-2。



2) 开始实验，加人 MLCK 酶。25°C，孵育 20 min(分钟)。

3) 将离心管置于冰上。从每管中取出 10-ul 等分试样，滴于一小面积的 P81 纸上。可用一条 P81 纸条, 在其上每隔 2~3 cm 用铅笔写上序号（与离心管的序号对应)。

4) 纸条用 75mmol/L 磷酸洗 3 次，用移液管手动搅拌 ，每次洗涤在玻璃烧杯中进行，用移液管转移纸条。第一次洗过的溶液应置于放射性废液中。洗毕，吹干,将纸条剪成小片，置闪烁瓶中计数。或者，纸条也可用丙酮洗涤，并用手持吹干机快速吹干（MarshA 和 Carroll,1991)。