钙调蛋白的胰蛋白酶消化实验

消化缓冲液 经 TPCK 处理的胰蛋白酶 HCl 纯的钙调蛋白

材料

经 TPCK 处理的胰蛋白酶（其干粉可从 WorthingtonBiochemicalCorp. 买到)

HCl(1 mmol/L)

纯的钙调蛋白（干粉；无盐（0.1~1 mg)

试剂

消化缓冲液

(配方，见"试剂的配制'，PP.82~83)

操作程序

1) 称重 0.1~1mg 胰蛋白酶于 1.5-ml 离心管，并溶于 1mmol/LHCl 中，终浓度为 1 mg/ml。置冰上。

2) 用消化缓冲液溶解钙调蛋白，终浓度为 1 mg/ml 置冰上。

3) 加一等分胰蛋白酶于钙调蛋白。该等分含胰蛋白酶的重量应为钙调蛋白总量的 1/100。例如，对 0.5 mg 钙调蛋白，加 5ug 胰蛋白酶（5ullmg/ml 胰蛋白酶储液)。

4) 盖紧离心管，反应混合物于 37°C 孵育 2 h。

5) 在消化反应正在进行的同时，置剩余的胰蛋白酶储液于冰上。2 h 后，加另一等分胰蛋白酶（重量还是钙调蛋白的 1/100) 于消化混合物。盖紧离心管，再继续在 37°C 下孵育 4~8 h(或过夜，如可能）。

6) 反应结束时，可将祥品冻干至所需要的程度，或真空离心缩小体积，或直接进样作 HPLC 分离。样品可用 HC1 或三氟乙酸酸化至 pH2~3 以终止反应。不过，采取此操作时，要担点风险，此时，有些等电点低的肽段可能会产生沉淀。