银染核仁形成区的标本制备及观察实验

HL-60细胞 HeLa细胞

Carnoy固定液 HCl 甲酸 AgNO3 蛋白胶 硫代硫酸钠 戊二醛 乙醇 丙酮 醋酸铀 柠檬酸铅染液

显微镜 电子显微镜 超薄切片机 水浴箱 离心机 天平 染色缸 平皿 乳头吸管 离心管 擦镜纸

一、中期染色体核仁形成区的银染和观察

1.  取制备好的正常或肿瘤细胞染色体标本，直接放入装有5 N HCl溶液中，常温处理5分钟。

2.  用自来水反复冲洗几次，甩干，标本面朝上平放在平皿中。

3.  将0.1%甲酸临用前配制的50%AgNO，溶液约0.5 ml，用吸管滴在标本上，再盖上二片擦镜纸。

4.  放置平皿于56℃水浴中处理3~5分钟，待擦镜纸呈棕色后，取出标本用水冲洗、气干。

5.  镜检

（1）镜下所见标本背景浅黄色，核型深染，端着丝粒染色体的银染蛋白存在的部位呈棕黑色颗粒，选择染色体分散良好，银染颗粒清楚的分裂相，进行计数单侧或双侧有银染颗粒的染色体数。

（2）人体细胞银染颗粒有遗传稳定性，一般正常值为4~8个/核型。

（3）计算方法：NOR   均值=N个核型中含NOR染色体数的和/N个核型

二、间期细胞核活性核仁形成区的银染与观察

1.  收集培养的HL-60细胞和用PHA转化的人正常外周血淋巴细胞分别于离心管中，用1 000 rpm 离心5分钟后弃上清。

2.  用吸管吸打或用指弹法使细胞悬浮，然后用Carnoy固定液固定30分钟。

3.  以1 000 rpm 离心5分钟，弃上清剩约0.5~0.1 ml 液体，使细胞悬浮后滴片。

4.  37℃干燥24小时

5.  银染

6.  镜检

（1）镜下所见，细胞核着色而细胞质不着色，核中活性核仁形成区银染颗粒呈棕黑色，成簇聚集，清晰可分。

（2）肿瘤细胞中与正常细胞中的银染颗粒数量、可见有明显差异。

三、间期细胞核银染活性核仁形成区电镜标本制备与观察

1.  收集培养的HL-60细胞或HeLa细胞于离心管中，随后加入2.5%戊二醛1 ml 预固定10分钟。

2.  以1 000 rpm 离心10分钟，弃上清后加入Carnoy固定液固定5分钟。

3.  接着以2 500 rpm 离心10分钟，弃净上清并用吸水纸吸干残余液体，用耳勺取出细胞团块放于小平皿中。

4.  100%乙醇→双蒸水梯度复水，每步5分钟。

5.  然后将细胞团切成约1 mm³大小的块。

6.  将50%AgNO₃（用蒸馏水配制）-2%蛋白胶（用1%甲酸配制）2：1混合液2~3 ml，加入有细胞团块的小平皿中。

7.  移置平皿于56℃水浴中处理20分钟。

8.  彻底水洗3次，每次2~3分钟。

9.  水洗后5%硫代硫酸钠室温处理10分钟。

10.  再水洗3次，转入乙醇一丙酮梯度脱水，每步5分钟。

11.  Epon812包埋。

12.  超簿切片直接地或再经醋酸铀和柠檬酸铅复染后，在电镜下观察。