长期培养检测法检测造血干细胞（LTCIC）

实验概要

长期培养检测法检测造血干细胞（LTC-IC）

主要试剂

DPBS，HSCs培养液，MethoCult®培养基，HSCs稀释液、细胞基础培养液、HLTM液体

主要设备

离心机，超净台，体视镜，倒置显微镜镜，96孔培养板、100 mm培养皿，3mL注射器，16号钝针头，移液器，涡旋仪，5 mL、10mL移液管，离心管

实验材料

M2-10B4成纤维细胞系（ATCC，CRL1942）

实验步骤

（1）制备饲养层细胞
（2.）HLTM液体分装
（3）接种被检测细胞
（4）细胞接种5～6周之后进行检测，每周半量换液。
（5）收集细胞进行检测。弃上清，加0.25%Tripsin进行消化，要求消化过程中在镜下观察，根据造血细胞和饲养层细胞消化时间不一样的原理，待饲养层还没有消化下来，造血细胞已经消化合适时用胰蛋白酶消化终止液终止消化。
（6）下面步骤同CFU检测方法（3）-（11）。
(3)准备三个35 mm的培养皿，制备双份培养系统。具体方法如下：把两个35mm的带盖培养皿和一个盛有水的35mm无盖培养皿一起放置到100 mm的培养皿中。
(4)准备CD34 细胞，细胞计数仪计数后用0.3mlIMDM 2%FBS稀释细胞至10倍的接种终浓度。推荐细胞数是每个3.5 cm培养皿500～2000个细胞。然后把稀释后的细胞悬液按照1：10的比例加到MethoCult®培养基中
 (5)将细胞转移到装有MethoCult®培养基的流式管后立刻剧烈涡悬振荡。然后静置5 min，使气泡消散。
(6)将无菌的16号钝端针头接到无菌的3mL注射器上，用注射器吸取MethoCult®培养基和细胞的混合物，每个3.5 cm培养皿中加入1.1mL，盖好盖子。每接种一支试管的混合物，用一套新的钝端针头和注射器。
(7)重复（5）-（6）中操作，将细胞接种到另外一个35 mm培养皿中。
(8)轻轻倾斜并旋转培养皿，使培养液在培养皿内铺满，并分布均匀。
(9)将接种好细胞的35 mm培养皿置于10 cm培养皿中，并在不盖盖子的35 mm培养皿中加入3 mL无菌水，把10 cm培养皿的盖子盖好。
(10)将培养皿置于CO₂培养箱中，培养14～16天。
(11)经过14～16天的培养后，进行克隆计数。
在培养的不同时期取1×10⁵个细胞进行CFU培养，随培养天数增加，CFU形成数量和种类都有所下降。