间充质干细胞的传代培养实验方法

试剂和材料：

1. 完全培养基：α-MEM：α-低限量基础培养基，含谷氨酰胺，无核苷酸或脱氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、经F杂交瘤纯化，非热灭活、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。过滤除菌。储存于4℃，不超过2周；

2.A；

3.胰蛋白酶/EDTA；

4.聚丙烯离心管，15ml和50ml；

5.塑料组织培养皿，直径15cm；

6.塑料微量移液器枪头，10—1000μl；

7.0.85%台盼蓝盐溶液；

8.微量移液器；

9.改良的Neubauer血细胞计数器

实验方法：

1. 在培养的MSCs细胞中小的、贴壁、纺锤形的成纤维细胞样细胞汇合至60%时，对其进行处理。如果单层细胞稀疏，则进行继续润洗和更换培养基；

2.按如下步骤消化单层细胞；

（1）用20ml预热的A润洗单层细胞后，加入5ml胰蛋白酶/EDTA；

（2）将培养皿置于37℃ 2min，在10&time放大倍数视野下观察单层细胞。贴壁细胞应正从塑料瓶上脱落；

（3）将培养皿置于37℃ 2min，再次观察。重复观察直至90%的MSCs已从培养瓶中脱落下来；

（4）加入5mlCCM，将10ml悬液移至15ml离心管中，500g离心10min；

（5）离心完毕，弃去上清，每管用1—2ml预热的A重悬沉淀。如有必要，混合多管细胞悬液只进行一次细胞计数；

3.取10μl细胞悬液加到10μl台盼蓝中，用血细胞计数器进行计数。合适的细胞悬液浓度为（2—5）&time10⁵个细胞/ml，存活率需高于80%。胰蛋白酶消化后用于传代的早期培养物悬液，亦可进行集落形成单位（CFU）测定、冻存或分化测定；

4.将细胞以50—100个细胞/cm的密度接种到培养皿中，保持低密度以保证快速的自我更新和多潜能特性。用预热CMM以7&time10³（最终浓度为50个细胞/cm2）到1&time10⁴（最终浓度为100个细胞/cm²）的密度重悬MSCs；

5.预备适当数量的15cm培养皿，加入25ml预热的CMM；

6.接种1ml步骤2和3所得的细胞悬液。来回滑动平皿（勿打圈）使细胞分布均匀。培养皿置于培养箱中，标记为一代细胞；

7.培养2—3天后，观察并评价形态。MSCs应为小的、纺锤体形状，频繁折光的双联体。此为培养良好的MSCs；

8.从培养皿中吸出培养基，用20ml预热的A润洗，加入25ml预热的新鲜CMM；

9.每次传代时所需的培养皿数量取决于可以接种的细胞数量。方案中的上述体积适用于MSCs接种单个15cm培养皿。如有需要可按此例扩大以接种多个培养皿；