间接染色步骤（细胞表面染色）

实验概要

间接标记需要两个孵育步骤，先与一抗再与合适的第二抗体孵育，二抗（不是一抗）结合了荧光染料（FITC、PE、Cy5 等）。请注意这是一个普遍的程序，您可以根据自己的使用情况进行调整。

实验步骤

1. 收集并洗涤细胞，然后确定细胞总数。

细胞通常在聚苯乙烯的圆底 12 x 75 mm² Falcon 管中染色。其实，细胞可以在任何适合离心机用的容器中染色，例如试管、EP 管、96 孔圆底酶标板。一般来说，细胞应该充分离心，以便去除上清时减少细胞损失；但也不能太剧烈，不然细胞会很难重悬。

离心后通常要检查细胞活性，应该在 95% 左右，不能小于 90%。

2. 用冰冷 PBS（10% 胎牛血清和 1% 叠氮化钠）将细胞重悬成约 1-5 × 10⁶ 个细胞/ml。

3. 每管中加入 100 μl 的细胞悬液。

4. 加入 0.1-10 μg/ml 的第一抗体，如有必要可用 3% BSA/PBS 稀释。

5. 在室温或 4 °C 避光至少孵育 30 分钟。

6. 400g 离心 5 分钟洗细胞并用冰冷 PBS 重悬，您需要根据细胞类型调整离心条件（离心力和时间）。

7. 用 3% BSA/PBS 将荧光标记的二抗稀释到最佳浓度（参照厂家说明书），然后用此溶液重悬细胞。

8. 在室温或 4 °C 至少孵育 20-30 分钟，必须避光。

9. 洗涤细胞三次，每次 400g 离心 5 分钟，并用冰冷 PBS 重悬，内含 3% 牛血清白蛋白和 1% 叠氮钠。

10. 将细胞悬液立即放于 4 °C 避光保存。

11. 为了获得最佳效果，应尽快进行流式细胞分析。