限制性内切酶消化DNA实验

限制性内切酶 DNA片段

TE 酶切缓冲液 EDTA

恒温水浴锅

1.  混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中

（1）x μl  DNA

（2）2 μl  10×酶切缓冲液

（3）18-x μl  H₂O

（4）20 μl 的反应体积可以方便地用于聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析。

（5）只要反应混合物中其他成分的比例保持一定，可增减待切割DNA的量和反应条件。

2.  加入限制性内切酶（1——5 U/μg DNA）在推荐的温度温育1 h （—般是37℃）。

3.  理论上，1 U 限制性内切酶在推荐的反应条件下，60 min 内可完全消化1 μg 纯化的样品。

4.  酶的体积应低于反应总体积的1/10，因为酶液中的甘油可以干扰反应。

5.  加入5 μl 电泳加样缓冲液终止反应，进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳。

6.  反应也可通过加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA（终浓度为12. 5 mol/l） 以螯合镁离于而终止。

7.  很多酶再65℃温育10 min 可被不可逆灭活，有些不能在65℃热失活的酶在75℃温育15 min 也能失活。

8.  如果酶对热具完全抗性，可遍过酚抽提和乙醇沉淀或通过硅基质悬浮法来纯化DNA。

在选择限制性内切酶时, 应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点 ,这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要。

1.分子克隆是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。

2.要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶液。取液时，Tip头要从溶液表面吸取，以防止Tip头沾去过多的液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱，防止限制性内切酶的失活。

3.凡用在酶切反应中的一切塑料器皿（Eppendorf管，Tip头等），都要新的，最后用重蒸水清洗，湿热灭菌，置50℃温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染。

4.当样品在37℃与65℃保温时，要注意：

（1）防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使反应溶液体积大量增加，造成实验失败。

（2）防止由于标签脱落，分不清样品类型。

5.由于温差原因，往往在盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心2秒钟，以集中体积内溶液，否则会发现酶切后体积少了。