青岛能源所开发出新型梭菌可控基因操作系统

　　解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)及其他纤维素降解梭菌能够通过整合生物加工技术的策略实现木质纤维素基生物燃料及化学品的合成。日前，中国科学院青岛生物能源与过程研究所代谢物组学团队在前期开发和优化的一系列基因操作工具(Cui GZ, et al, J Microbiol Methods, 2012, 89: 201-8.； Mohr G, Hong W, et al, PloS One 2013, 8:e69032； Cui GZ, Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98: 313-23.)的基础上，进一步开发了新型梭菌可控基因操作系统，有力推动了梭菌代谢工程研究，促进了木质纤维素生物转化的工业化进程。相关成果于3月4日在线发表在Biotechnology for Biofuels (Zhang J, et al, 2015, 8:36)。

　　国内外研究学者已经针对梭菌开发出不同的遗传改造工具，包括用于基因敲除的同源重组及二类内含子打靶方法，用于外源基因表达的基因组整合及质粒表达方法等。单到目前为止仍较缺乏实现基因可控诱导表达的高效、严谨工具。

　　博士生张杰、副研究员刘亚君等构建了以阿拉伯糖为特异性诱导剂的高效可控诱导表达系统ARAi，该系统包括具有不依赖于氧气的荧光蛋白报告基因的诱导表达平台(图1A)，基于毒力基因MazF的灵敏的反筛标记以及可用于基因精准打靶的诱导型ClosTron系统。ARAi所具有的阿拉伯糖诱导启动子来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，在有诱导剂存在条件下，其基因表达水平能上调800倍以上(图1B)，这是已知梭菌诱导表达系统中的最高效率。此外，该研究构建的诱导型ClosTron系统的脱靶率从原先的100%下降到0，彻底解决了ClosTron的脱靶问题，实现了精准的基因敲除。

　　基于对中温及嗜热梭菌遗传改造技术研究的成果和经验，刘亚君于3月3日在Biotechnology Journal 在线发表相关综述文章(Liu YJ, et al, 2015. doi:10.1002/biot.201400716)，对基于二类内含子的targetron基因打靶技术及其在代谢工程中的应用进行了系统阐述(图2)，同时展示了该团队近年来在梭菌改造领域的最新进展。

　　上述研究由研究员崔球主持完成，获得了科技部“973”、国家自然科学基金、青岛市科技发展基金等的支持。

图1. ARAi系统在解纤维梭菌中的诱导作用。A, 不依赖于氧气的绿色荧光蛋白在解纤维梭菌中的诱导表达。1,2，无诱导剂；3,4，添加阿拉伯糖作为诱导剂；1,3，细胞形态；2,4，荧光检测。B, 以X-gluc为底物检测GusA蛋白在解纤维梭菌中的诱导表达。1-3，不添加细胞裂解液或不添加诱导剂的阴性对照；4-6，添加0.1、1或10 g/L阿拉伯糖进行诱导表达。C, 以MUG为底物检测GusA蛋白在解纤维梭菌中的诱导表达。在有诱导剂存在条件下，基因表达水平可上调超过800倍。

图2. Targetron结构及其归巢机制示意图。P，启动子；T，终止子；RT，反转录酶；RNP，核糖核蛋白体；E1，E2，DNA靶位点的5’端及3’端外显子；浅蓝色短线表示intron RNA与DNA靶位点的识别及相互作用；桔色短线表示反转录酶与靶位点的识别及相互作用。