2024年10月5日，深圳湾实验室、北京大学、清华大学等单位的科研人员合作在Nature Communications期刊发表了题为Biofunctionalized dissolvable hydrogel microbeads enable efficient characterization of native protein complexes的研究论文，主要报道了一个新型非变性蛋白质复合物的高效纯化及表征方案SNAP-MS (Stationary-phase-dissolvable Native Affinity Purification and Mass Spectrometric characterization）。
研究人员利用水凝胶材料开发了新型可溶性亲和微珠，捕获目标蛋白或复合物后，采用溶解的方式将目标蛋白回收至溶液中，该溶液可与质谱兼容，直接用于非变性质谱表征（图1）。文中将这种新型纯化方法与之前传统的亲和纯化策略进行了多方面的对比，也进行了自身材料的优化，对这部分内容感兴趣的小伙伴们可以在原文中获得更多的信息。
图1 SNAP-MS 流程
而作为质谱技术的爱好者们，相信大家也都关注到了，文章中主要的蛋白表征手段是非变性质谱分析，数据采集使用了 Orbitrap Q Exactive UHMR 质谱仪。提到这台仪器，脑子里冒出的关键词基本上都是和大分子量有关系了，m/z高，特殊优化的离子传输组件，源内捕获等等等等，可能大家也好奇它的数据质量到底怎样，那么我们就以文中的几个图给大家做个展示。
1、获取蛋白复合物的化学计量信息
图2 纯化的 EGFP 或 mEGFP 与 Ab结合复合物的非变性完整分子量及二级质谱谱图
2、Top-down 分析
为了比较经过 SNAP 方法纯化获取的蛋白与原始形态的蛋白之间的区别，除了分子量层面的对比以外，作者还使用top-down分析的方法对比了两者的碎片信息。捕获得到的生物素-亲和素复合物经过源内碎裂先后释放出诱饵生物素和亲和素蛋白单体，后者再经过 pseudo-MS3进行特定蛋白型（proteoform）的片段分析，从而实现复合物-单体-肽段的全链条top-down分析。图3 展示了SNAP方法纯化的亲和素单体与原始亲和素单体的碎片离子相关性。
图3 比较纯化回收和原始形态的亲和素复合物解离（左）、单体蛋白型分布（中）和pseudo-MS3谱图（右）
3、解析异质性高的糖蛋白
文中采用SNAP beads方法纯化了人血浆中的结合珠蛋白haptoglobin（Hp），诱饵蛋白使用了血红蛋白hemoglobin（Hb），最终获得了Hp-Hb的复合物（图4A）。Hp肽链长度多样，多个糖基化修饰，不同聚体形态和结合形态，是一个高异质性的糖蛋白。通过非变性质谱的分析可知，4个不同血清样品获取的Hp的聚合形态并不相同（图4B）。在血清中加入游离 Hb（模拟溶血条件），经非变性质谱的分析可知 Hb在 Hp-Hb复合物中的占比（图4C）。此外，由于诱饵Hb蛋白上有一个额外的linker基团，所以相比游离 Hb 蛋白，会产生一个 126 Da的质量偏差。采用进一步的二级碎裂将Hb从Hp-Hb复合物中释放出来，比较两者的谱图可对它们进行区分（图4D）。
图4 使用SNAP-MS 纯化并表征人类血浆中的Hp蛋白
从图中，我们可以发现，由于高异质性，Hp的质谱图即使是在非变性条件下，仍然呈现很宽的质量数分布，对数据解析引入了很大的挑战。
此时，依然结合在目标蛋白上的诱饵蛋白，可用于减少电荷价态，并进行质量纠正。通过二级质谱碎裂，将Hb诱饵蛋白从复合物中释放出去，可显著降低剩下的目标蛋白的价态、提升价态分辨（图4E），并利用碎裂反应的质量守恒作为约束条件校正传统解卷积算法产生的分子量偏差，有利于谱图的数据解析。
作为一种通用策略，SNAP-MS既可以单独使用，也可以与其他方法(如cryo-EM)结合使用，以更详细地表征各种天然蛋白复合物的结构。另外，通过上面几个文章中的实例，我们可以知道非变性质谱表征，从来就不止是分子量的故事，我们也期待看到更多的数据更多的应用。
专家访谈
王冠博
北京大学生物医学前沿创新中心，研究员
Q1 ：请您谈谈本研究的难点在哪里？
作为一个主要面向蛋白复合物的分析策略，非变性质谱最终需要解决生物医学分析中的问题。尽管质谱对纯度的要求相对较低，非变性质谱的应用多年来仍然主要局限在高度纯化的蛋白以及体外重构的复合物范畴，尚不能作为生物样本乃至临床样本的常规分析手段提供更直接的信息。思维惯性是技术开发和应用中的最大困难，如何与生物医学需求有效对接是我们面临的切实要务。清华大学王建斌教授不仅了解生物学家的需求，对化学分析原理也有很精深的见解，这样的合作促使我们用新思维去尝试提升理论性能到实际价值的转化率。课题也得到清华大学王宏伟教授的大力指导，强化了纯化、质谱和冷冻电镜的对接。合成体系优化以及流程细节验证都导致课题执行周期远超预期，两位一作在文章发表前已经博士毕业，重重压力也是实际需要克服的困难。
Q2 ：UHMR 组合型四极杆 Orbitrap质谱仪在该研究中发挥了怎样的作用？
我们的目标体系呈现分子量分布宽和异质性高两大特点：目标复合物分子量动辄达到数百万道尔顿（MDa），要求仪器有充分的质量检测范围；大量目标蛋白存在糖基化等复杂修饰，高异质性导致信号难以解析，我们所开发的一系列解决方案也要求仪器具有充分的分辨能力。我在荷兰Heck课题组工作期间参与了UHMR原型机验证，对它的性能有比较早的了解；我们的质谱团队在北大黄岩谊教授支持下购置了国内第一台UHMR仪器，它同时具备的超高质量范围和超高分辨两大性能提供了胜任研究目标的硬件保障。
Q3 ：本研究开发的SNAP-MS技术流程对实现天然蛋白复合物的高效分析及应用有哪些深远意义？
首先谈不上深远，我们这个课题的初心是能为蛋白结构质谱应用于生物样本乃至临床样本发挥一小步实实在在的推进作用。文章发表只能说明数据结果获得了评阅同行和编辑的认可，技术就绪程度还需要业界的广泛检验。先驱们打出了非变性质谱、top-down组学等结构质谱策略的旗帜，我们希望能作为火把传递的一员为这些技术的普适工具化出一份力。SNAP-MS只是一个开端，我们会继续以实际应用场景作为指引，结合仪器的优势性能，在天然化、原位化的方向上尝试一系列的技术拓展，努力让更多结构质谱方法呼之即来，来则可用。
专家简介
王冠博，北京大学生物医学前沿创新中心研究员。北京大学学士，美国马萨诸塞大学博士；曾于荷兰蛋白质组学中心从事博士后研究；曾任南京师范大学教授、博士生导师。主要从事免疫反应相关蛋白质的高级结构及相互作用研究，以生物质谱为核心工具，结合新型分析设备研发，发展一系列新型技术，在多个结构层次实现对高复杂度蛋白的动态结构分析，应用于免疫反应分子机制研究、生物药物研发等领域。成果发表于Nat. Commun.、PNAS、Mol. Cell等期刊；获国内外多项授权专利。著有《Mass Spectrometry in Biopharmaceutical Analysis》等专著、译著、合著多部。任中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业分会委员、国际学术组织Consortium for Top-Down Proteomics青委会委员。
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