非标记抗体免疫电镜实验

实验方法原理 标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响；结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合，影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素，通过一系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的F(ab′)2，一个Fab片段与标本中的抗原结合，一个Fab是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后，再加入铁蛋白与抗体结合，从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后，直接电镜观察。

实验材料 病毒材料

试剂、试剂盒 抗体磷钨酸琼脂糖

仪器、耗材 高速离心机铜网Fomnvar膜透射电子显微镜离心管

实验步骤

一、材料及试剂

1.  待检病毒材料  如粪便，气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。

2.  高速离心机

3.  已知抗体

4.  磷钨酸

5.  琼脂糖

6.  其它

二、操作方法

1.   将被检病毒材料0.9 ml，加1︰5～1︰10稀释的特异性免疫血清0.1 ml充分混合。

2.   置37℃作用1 h或37℃1 h后再置4℃过夜。

3.   以17 000 r/min～23 000 r/min离心90 min。

4.   吸去上清，将离心管口倒置于滤纸上，吸去残留液体。

5.   沉淀物中加少量H2O混悬，用3%磷钨酸(pH6.0)负染20 s～30 s，滴加于400目铜网Fomnvar膜上，用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。

6.  在透射电镜下4×104倍观察。

三、结果判定

直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入，大大提高了观察的敏感性。