非洲粟酒裂殖酵母的LiAc转化法
非洲粟酒裂殖酵母的电穿孔转化法
| 实验材料 | 细胞 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 腺嘌呤 亮氨酸 LiAc |
| 仪器、耗材 | YEA 平板 |
| 实验步骤 | 1. 在 YEA 平板上培养细胞直到长成可见单菌落。 2. 接种单菌落到添加有 150 mg/L 腺嘌呤、亮氨酸和/或尿嘧啶等营养缺陷互补物的 YEA 或 PM 培养基中，于允许温度以 200 r/min 振荡培养防止酵母菌沉积，使细胞滴度达到每毫升 5X106 到 1X107 个细胞。 3. 1000~2000 g 离心 5 分钟，用灭菌蒸馏水洗一遍。 4. 用过滤除菌的 0.1 mol/L CH3COOLi，pH 4.9 洗一遍。 5. 重悬于 0.1 mol/L 的 LiAc 使细胞滴度为每毫升 109 个细胞，取 100 μl 等份转移到微量离心管中，在允许温度孵育 60 分钟。 6. 加 1 μg 溶于 15 μl TE 中的质粒 DNA，轻轻旋转混匀，于允许温度孵育 60 分钟。 7. 加 290 μl 预热到允许温度的 50% PEG3350，轻轻旋转混匀。于允许温度孵育 60 分钟。 8. 于 42℃ 热休克 15 分钟，允许温度下使细胞恢复 10 分钟。9000 r/min 离心 2 分钟沉淀细胞。 9. 用 1 ml 非选择性基本培养基重悬细胞，转移到 10 ml 非选择性基本培养基中。于允许温度孵育 30 分钟，剧烈振荡以保持细胞的悬浮状态。然后置于室温不摇孵育 30~90 分钟。 10. 2000~4000 g 离心 10 分钟沉淀细胞，重悬于合适体积的选择性基本培养基中涂板，平板为 PM。 |
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