非肌肉肌动蛋白的纯化
| 实验材料 | 非肌肉肌动蛋白 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | DNA 酶Ⅰ缓冲液 |
| 仪器、耗材 | DEAE 柱 |
| 实验步骤 | 1. 准备贮存液和材料。 2x DNA 酶Ⅰ缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 1 mmol/L DTT 0.4 mmol/L CaCI2 0.4 mmol/L ATP 抑蛋白酶肽 抑蛋白酶 亮抑蛋白酶肽 抑胃酶肽 A PMSF TPCK 50% 甲醛在 DNA 酶柱缓冲液中 0.4 mol/L NH4CI 在 DNA 酶Ⅰ缓冲液中 0.3 mol/L KCl 在 DNA 酶Ⅰ缓冲液中 DNA酶Ⅰ柱缓冲液 2. 准备一个 5~10 ml 的 DNA 酶Ⅰ的亲和柱。 3. 准备一个 0.2 ~1 ml 的 DEAE 柱：用 DNA 酶Ⅰ缓冲液平衡的 DEAE-纤维素。 4. 通过离心收集细胞并用等渗盐溶液（例如 PBS ) 洗去培养液。 5. 在加蛋白酶抑制剂的 DNA 酶柱缓冲液中重悬细胞沉淀物。 6. 用对于感兴趣细胞的标准方法进行细胞匀浆。 7. 用相差显微镜证实超过 99% 的细胞已经裂解了。 8. 100000 g 离心裂解物 45 分钟。 9. 用巴斯德吸管转移上清，避免混入脂肪。 10. 柱子上样： (1) 上清和用 DNA 酶Ⅰ缓冲液加蛋白酶抑制剂平衡了的 DNA 酶Ⅰ亲和介质混合，并把介质/蛋白混合物倒到一个小杆子中。 (2) 在装填柱子时收集流出液，通过用抗肌动蛋白抗体进行的免疫印迹、DNA 酶Ⅰ抑制分析或 SDS-PAGE 来证实有大量肌动蛋白留在柱子中。 11. 用 2 倍体积含蛋白酶抑制剂的 DNA 酶柱缓冲液洗柱子，然后用含蛋白酶抑制剂和 0.4 mol/L NH4Cl 的 DNA 酶柱缓冲液洗柱子。 12. 用含 50% 甲醛的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗脱肌动蛋白。 13. 立即把 50% 甲醛洗脱液上样到 0.2~1 ml DEAE 柱子上。 14. 用 5 倍体积的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗 DEAE 柱，然后用含 0.3 mol/L KCl 的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗脱。分部收集，每管 200 μl。 15. 检测收集液的蛋白浓度，然后混合出峰时的收集液。 16. 加 MgCl2 使浓度为 2 mmol/L ( 这是选用于天然肌动蛋白），以使肌动蛋白聚合，用 SDS-PAGE 分析多肽组成。 产量应该是 5% 左右，所以从湿重 10 g 的细胞指望得到 2.5~5 mg 纯化了的肌动蛋白是合理的。 |
山东博纳生物科技集团有限公司（以下简称“博纳生物”）宣布完成A轮融资，融资总额近亿元人民币。本轮融资由鲁信创投领投，济高财金跟投，生命资本担任独家财务顾问。本轮投资者对博纳生物的发展前景深具信心，将通......
记者从中国科学院长春应用化学研究所了解到，该所绿色分离化学与清洁冶金课题组在废旧动力锂电池分离回收新工艺上取得新突破。课题组负责人陈继介绍，我国动力锂电池生产、使用和出口均居世界前列。锂电回收和循环利......
介绍在抗体药物纯化工艺中，通常采用经典的三步或两步层析法，蛋白A（ProteinA）亲和介质（填料）因其配基上有多个区域对抗体Fc片段具有特异性吸附能力，因此广泛用于抗体捕获步骤（第一步层析）。通过一......
药物的分离纯化是从合成或天然来源中获得的药物混合物中，将目标化合物纯化为高纯度的过程。这是药物研发和制造过程中非常重要的步骤，因为高纯度的药物确保了其安全性和有效性。药物的分离纯化通常涉及以下一般步骤......
“玩了一辈子沙子”，这是艾捷博雅生物集团董事长汪群杰对自己的描述。从研究生、博士到博士后，汪群杰一直在做有机硅材料，入职安捷伦后开始接触色谱分离材料，在以硅材料为核心的分离材料上有深厚的沉淀。从安捷伦......
近日，中国科学院上海有机化学研究所质谱引导的SFC/UFPLC切换高通量自动纯化系统采购项目公开招标。项目编号：OITC-G220300352项目名称：中国科学院上海有机化学研究所质谱引导的SFC/U......
融胶液，可以使琼脂糖凝胶完全融化。同时采用了一种新型的离子交换柱，在特定条件下，使DNA能在离心过柱的瞬间，结合到DNA纯化柱上，在一定条件下又能将DNA充分洗脱，从而实现DNA的快速纯化。1.低熔点......
PCR产物的直接纯化：一、原理PCR产物一般都含有过量的引物、TaqDNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程,因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多,商用......
蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。图片来源于网络根据蛋......
分析测试百科网讯2019年4月3日，艾杰尔-飞诺美第1000台CHEETAH交付仪式在宁波康龙化成举办。本次交付的第1000台纯化仪器是CHEETAHII快速中压纯化色谱，是历经十年颇受好评的CHEE......