用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸标记哺乳动物细胞
酵母和细菌蛋白质的代谢放射标记
| 实验材料 | 细胞 |
|---|---|
| 仪器、耗材 | 培养基 |
| 实验步骤 | 1. 制备活跃生长着的细胞。从单层培养细胞（约铺满 75%
表面积）中吸去培养基。用预热至 37℃ 的无血清培养基冲洗两次（培养基中应该不含蛋氨酸和半胱氨酸）。对于悬浮培养细胞，通过 400 g 离心 5
分钟收集细胞。用顶热至 37℃ 的无蛋氨酸培养基重悬沉淀，400 g 离心 5 分钟。尽可能地去掉上清，用无蛋氨酸培养基重悬细胞至 107 细胞/ml 后转移至一块小培养板。 2. 加入预热的无蛋氨酸和半胱氨酸的培养基，于 37℃ 培养 20 分钟，以耗尽胞内含硫氨基酸库。 3. 吸去培养基，立刻换上预热的、无蛋氨酸和半胱氨酸何含有适量标记氨基酸的新鲜培养基，依据预实验结果，将细胞于 37℃ 培养一定时间（对于末做过预实验的蛋白质，以 2~4 小时作为初始值比较合适） 4. 移去放射性培养基。对于单层培养细胞，吸出即可。悬浮培养细胞则可转至试管，400 g 离心 5 分钟，倒去上清。 5. 准备一块冻至 0℃ 的平板（如放在冰盒上的铝板），将单层细胞培养板放上去。用冰冷的 PBS 冲洗两次，冲洗液都到进放射性废料桶。悬浮培养细胞用 PBS 重悬，400 g 离心 5 分钟，倒去上清。 6. 抽干细胞上残留的 PBS，裂解细胞。 |
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