预处理法提取土壤DNA

预处理法提取土壤DNA

实验试剂

1.      TENP缓冲液：50 mM Tris，20 mM EDTA，100mM NaCl，1% PVPP，pH10

2.      PBS缓冲液：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，pH7.4

3.      DNA提取缓冲液： TrisBase 0.1M, EDTA 0.1M, NaCl 1.5M, CTAB 1%

4.      溶菌酶（10 mg/ml）

5.      蛋白酶K(20 mg/ml)

6.      SDS (20%，m/V)

7.      氯仿：异戊醇（24：1）

实验步骤

1.        取1 g土壤，加入6 ml TENP缓冲液，涡旋震荡混匀10 min，12000 rpm离心5 min，弃上清，重复洗涤3次；

2.        土壤沉淀再加入6 ml PBS缓冲液，洗涤一次，弃上清；

3.        加入37 ℃预热的13.5 ml DNA提取缓冲液，再加入100 μl溶菌酶，50 μl蛋白酶K，水平摇床上225 rpm，37 ℃摇动30 min；

4.        再加入1.5 ml SDS，65 ℃水浴2 h，其间间隔20 min混匀一次；

5.        6000 g室温离心15 min，上清液转入新的离心管中；

6.        分别加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），混匀，6000 g离心15 min，取上清，重复抽提一次；加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置1 h；

7.        15000 rpm室温离心20 min，沉淀用70%乙醇清洗2次，风干；

8.        用100 μl无菌去离子水重新悬浮。