颜宁团队首次解析被发现20多年的钠离子通道蛋白

　　NaChBac是第一个被表征为电压门控的Na +（Nav）通道，已经成为研究Nav通道结构与功能关系的原核原型。在近二十年前发现的NaChBac的结构尚未确定。

　　2020年6月8日，颜宁团队在PNAS 在线发表题为“Employing NaChBac for cryo-EM analysis of toxin action on voltage-gated Na+ channels in nanodisc”的研究论文，该研究介绍在洗涤剂胶束和纳米圆盘中NaChBac的单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析。在两种条件下，NaChBac的构象与潜在灭活的NavAb的构象几乎相同。确定纳米光盘中NaChBac的结构使研究人员能够检查脂质双层中Nav通道的门控修饰剂毒素（GMT）。

　　为了研究哺乳动物Nav通道中的GMT，该研究生成了一个嵌合体，其中Nav1.7的第二个电压感测域中S3和S4区段的细胞外片段替换了NaChBac中的相应序列。此解决方案可实现毒素对接的可视化。因此，NaChBac可以用作膜环境中GMT与Nav通道之间相互作用的结构研究的便捷替代品。

　　另外，2020年5月13日，颜宁等团队在Nature 在线发表题为”Structural basis for catalysis and substrate specificity of human ACAT1“的研究论文，该研究介绍了人类ACAT1的冷冻电子显微镜结构。每个protomer都由九个跨膜段组成，这些段包围了一个胞质通道和一个在预计的催化位点会聚的跨膜通道。结构指导的突变分析的证据表明，酰基辅酶A通过细胞质通道进入活性位点，而胆固醇可能从侧面通过跨膜通道进入。这种结构和生化特征有助于合理化ACAT1对不饱和酰基链的偏好，并提供对MBOAT家族中酶催化机制的见解。

　　2020年5月13日，颜宁等团队在Nature 在线发表题为”Structure and mechanism of human diacylglycerol O-acyltransferase 1“的研究论文，该研究介绍了人类DGAT1的冷冻电子显微镜结构。每个DGAT1都有9个跨膜螺旋，其中8个形成保守的结构折叠，将其命名为MBOAT折叠。DGAT1中的MBOAT折叠在膜中形成一个中空腔室，该腔室包围着高度保守的催化残留物。该腔室有两个底物，脂肪酰基辅酶A和二酰基甘油的单独入口。 DGAT1可以同型二聚体或同型四聚体形式存在，两种形式具有相似的酶活性。DGAT1的N末端与邻近的protomer相互作用，而这些相互作用是酶促活性所必需的。

　　电压门控钠（Nav）通道通过响应可激发细胞中跨膜电场（膜电位）的变化，选择性地将Na +渗透到整个细胞膜上来启动和传播动作电位。在人类中，Nav通道有9个亚型，即Nav1.1至1.9，其在电子信号中的核心作用反映在与Nav通道异常功能相关的各种疾病中。迄今为止，已在人类Nav通道中鉴定出1,000多种突变，这些突变与癫痫，心律不齐，疼痛综合征，自闭症谱系障碍和其他疾病有关。Nav通道的结构和功能机制的阐明将有助于对基础生物学的理解，并有助于潜在的临床应用。

　　真核Nav通道由成孔的α亚基和辅助亚基组成。α亚基由一条多肽链构成，该多肽链折叠成六个跨膜段（S1到S6）的四个重复域（I到IV）。来自每个部分的S5和S6片段构成通道的孔区域，其侧翼是由S1至S4形成的四个电压感测域（VSD）。VSD是一个相对独立的结构实体，为依赖电压的通道（Nav，Kv和Cav通道）和酶中的电压传感提供了分子基础。

　　由于冷冻电子显微镜（cryo-EM）的技术进步，能够分辨来自不同物种的Cav和Nav通道的原子结构，并具有独特的辅助亚基，动物毒素和FDA批准的药物。Nav1.7的突变与各种疼痛疾病有关，例如对疼痛漠不关心或极端疼痛综合症。在存在β1和β2亚基的情况下，确定了结合孔阻断剂（Protoxin II与河豚毒素；Huwentoxin IV [HWTX-IV]与saxitoxin）及结合的狼蛛门控修饰剂毒素（GMT）的人Nav1.7的结构，总分辨率为3.2Å。毒素的较差分辨率可能是由于去污剂胶束中与膜的相互作用丧失所致。据报道，完整的膜可促进这些毒素的作用。

　　来自嗜碱性芽孢杆菌的NaChBac是第一个被鉴定的原核Nav通道。随后对该家族的更多直系同源物进行了表征。与真核对应物相反，细菌Nav通道是6-TM亚基的同源四聚体。以NavAb和NavRh为例的细菌Nav通道已被用作结构-功能关系研究的重要模型系统。尽管在二十年前被发现，原型NaChBac的结构仍然未知。

　　在原核和真核Nav通道之间，所表征的GMT结合位点不保守。在这些嵌合体中，VSDs的细胞外半部分被真核对应物的相应序列取代。这些研究为VMT上GMT的功能提供了重要的见识，并促进了在不同构象中Nav通道的结构阐明。

　　最常用的支架蛋白是NavAb。但是，NavAb在昆虫细胞中的过表达和纯化既昂贵又缓慢。可替代地，NavRh不能被记录在任何测试的异源系统中。因此，该研究专注于NaChBac。通过克服适用于冷冻EM分析的重组NaChBac的技术挑战，该研究能够解决洗涤剂胶束和纳米圆盘中NaChBac的结构。产生了能与HWTX-IV结合的NaChBac嵌合体。在纳米圆盘中，其单独结构以及与HWTX-IV的结构分别确定为3.5和3.2Å分辨率。

　　为了研究哺乳动物Nav通道中的GMT，该研究生成了一个嵌合体，其中Nav1.7的第二个电压感测域中S3和S4区段的细胞外片段替换了NaChBac中的相应序列。单独和与HuwenToxin IV（HWTX-IV）配合使用的纳米盘嵌入嵌合体的Cryo-EM结构分别确定为3.5和3.2Å分辨率。与HWTX-IV结合的人Nav1.7的结构相比，该结构的总分辨率为3.2Å，毒素的局部分辨率已从约6Å提升到了约4Å。此解决方案可实现毒素对接的可视化。因此，NaChBac可以用作膜环境中GMT与Nav通道之间相互作用的结构研究的便捷替代品。

　　参考消息：

　　https://www.pnas.org/content/early/2020/06/05/1922903117