飞行时间质谱技术与丝状真菌

　　侵袭性真菌感染是重症监护和器官移植患者死亡的高风险因素，其早期诊治对提高救治率至关重要。其中，丝状真菌是侵袭性真菌感染的主要病原菌之一，但丝状真菌生长缓慢（一般需要5～7d）限制了早期诊断，丝状真菌的早期鉴定与耐药性增强已成为临床救治的重大难题。目前，丝状真菌常用的鉴定方法为镜检和菌落形态联合鉴定，但不足之处是易受检验人员主观判断影响。

　　MALDI-TOF MS 技术的鉴定原理

　　MALDI-TOF MS 技术是近几年发展起来的，用于临床分离病原菌全细胞鉴定的软电离技术，其主要是针对菌种特异性核糖体蛋白进行检测，具有操作简单、快速、准确等优点。

　　MALDI-TOF MS 主要由MALDI 和TOF 两部分组成。

　　MALDI技术的工作原理：激光照射样品蛋白与过饱和的基质溶液形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量并与样品蛋白解吸附使样品电离，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，从而使生物分子电离。

　　TOF的工作原理：不同质荷比（m/z）的离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的时间不同，获得细菌特异的质谱指纹峰图。将该峰图与标准数据库图谱进行比对，根据匹配结果进行判读。分值越高，匹配效果越好，准确度越高。鉴定结果的评分范围0～3.0，数值＞2.0 表明鉴定结果可达到菌种水平，1.7～2.0 表明鉴定结果仅达到菌属水平，＜1.7 为未达到菌属水平，结果不可信。

　　由于微生物菌种或菌属存在不同程度的种内差异，如核苷酸顺序、生化反应、指纹图谱类型等，因此，数据库指纹图谱应该足够全面。

　　MALDI-TOF MS 技术鉴定丝状真菌的前处理

　　丝状真菌的鉴定准确性较差，且由于细胞壁厚和形态特征变化大，诊断方法一直难以突破。MALDI-TOF MS技术鉴定丝状真菌基本步骤包括点靶、前处理、上机，其中难度最大的是丝状真菌的前处理，即破壁。前处理也是影响丝状真菌鉴定效果的主要因素。丝状真菌细胞壁厚，为100～200 nm，且细胞壁的韧性和稳定性都较强，普通的前处理方式难以奏效。Vermeulen 等分析了MALDI-TOF MS 技术鉴定完整丝状真菌细胞和裂解后细胞的效果，结果显示，细胞裂解法明显优于完整细胞法。

　　De Carolis 等通过对103 株丝状真菌（曲霉菌、镰刀菌、毛霉目菌）运用真菌孢子和水混合直接点靶的完整细胞法处理，使用MALDI-TOF MS技术进行鉴定，发现94株已知菌中，91株能鉴定到菌种水平。同样，Nenoff 等使用完整细胞法对285株皮肤真菌（红色毛癣菌、毛孢子菌等）的研究显示，78.2% 的丝状真菌可以鉴定到菌种水平。

　　细胞裂解法目前主要包括磁珠破碎法、海沙/丙酮  -乙醇/甲酸乙腈提取法和旋转培养法等。

　　磁珠破碎法的优点在于可以对丝状真菌充分研磨从而达到破壁效果，缺点在于操作比较繁琐。2008年Hettick等运用磁珠破碎法对12株青霉菌样本进行分析，结果显示，该方法对青霉菌鉴定的准确率达到100%。此外，12株曲霉菌属和5株不同的黄曲霉菌的鉴定结果表明其可以达到菌种水平的准确鉴定。该方法具有很高的重复性，Lau等 采用磁珠破碎法对421株固体培养基上生长的丝状真菌鉴定，结果显示，菌种和菌属的鉴定准确性分别达到370（88.9%）株和388（93.2%）株。

　　另外一种破壁的方式是甲酸乙腈前处理，也是临床实验室最常用的方法。Schrödl 等 对4株不同的横梗霉进行甲酸乙腈提取法处理，实现了在菌种水平100%的准确鉴定率。Bille等在甲酸乙腈提取法的基础上进行了简化，将64株曲霉菌的孢子或菌丝与靶板上甲酸乙腈（1μl 70%）预混后对细胞进行裂解，使用该裂解方法检测准确率可以达到86%，与Iriart等应用甲酸乙腈提取法鉴定44株曲霉菌的效果（81.1%)相当，甲酸乙腈提取方法同样适用于丝孢菌属、镰刀菌属、横梗霉菌属和皮肤癣菌的鉴定。

　　最后一种方式是旋转培养法，该方法可以得到均一的菌丝体，有利于丝状真菌细胞壁的破坏。黄艳飞等运用旋转培养法对380株丝状真菌培养鉴定，其鉴定菌属和菌种的准确率分别为94.0%和76.0%。因此，实验室在鉴定丝状真菌时可以根据自身实验室条件和实验需要选择合适的前处理方法，从而达到满意的鉴定结果。