饲用酶制剂的研究进展

饲用酶制剂是指利用微生物技术生产的胞外酶，通常用作饲料添加剂，对于消除抗营养因子、提高资源利用率、开辟新的饲料来源以及解决畜牧业环境污染具有重要作用。近几年，饲用酶制剂在农业生产上得到了广泛应用，研究十分活跃，应用前景广阔。 目前，在酶的效力和投人产出比方面似乎仍有争议。今后的研究，除注重酶在饲料中的应用条件及依据特定饲料组分而设计酶制剂外，重点是改进已生产的酶制剂的质量和效能，借助DNA重组技术以微生物、植物种籽及动物自身来生产酶，建立评估各种酶产品的标准程序，及在预测酶对各种动物和各种饲料效果的模式等方面加大研究力度。特别是基因工程技术在饲用酶制剂研究中的应用，已成为世界各国尤其是发达国家进行酶制剂研究与生产的主要手段。 

基因工程技术在饲料用酶中的应用主要包括两个方面：（1）利用重组微生物反应器高效表达目的酶，降低生产成本。（2）利用基因工程技术改良饲用酶制剂，提高酶的质量与效率。随着基因工程技术的发展，通过将部分微生物的基因改造，例如，通过基因工程手段，将酶蛋白的基本结构改变，强化酶在某方面的功能特性的这一做法已成为商业上成功的典范，然而，这种做法给酶制剂的应用带来安全的隐患。所以，对经改造，尤其是经过基因技术改造的酶制剂，必须经过合理的、必要的安全评价才能工业化生产和应用。 蛋白酶研究进展 蛋白酶是催化蛋白质水解的酶类，是农业上应用最多的酶制剂之一。蛋白酶制剂的种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，等等。

蛋白酶广泛存在于人和动物的消化道中，在植物及微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，农业上用蛋白酶制剂主要通过微生物发酵来生产，所以饲用蛋白酶主要来源于微生物，生产蛋白酶的微生物种类很多，有细菌和真菌，如芽孢杆菌属（Bacillus）、曲霉属(Aspergillus)、青霉属（Penicillum），等等。 在单胃动物饲料中添加蛋白酶主要有两大作用，一是补充动物体内源蛋白酶的不足。幼猪和幼禽消化系统发育不完善，产酶不足，微生物活性较低，在饲料中添加蛋白酶就可以帮助幼龄动物对蛋白质的消化。二是消除抗营养因子的作用。饲料中植物性成分，特别是豆类植物，广泛存在蛋白酶抑制剂和凝集素，它们对饲料营养价值有很大影响，不过对家禽而言，还有待进一步的研究。

实验表明，许多微生物蛋白酶可以降解动物消化道中对蛋白酶有抑制作用的蛋白酶抑制剂和凝集素，消除它们的影响，减轻这些因子的抗营养作用。 反刍动物既能利用植物性蛋白也能利用动物性蛋白，大部分植物蛋白和全部的非蛋白氮被瘤胃中微生物分解，合成菌体蛋白，菌体蛋白被动物分泌的蛋白酶消化吸收。 目前，通过基因突变来改良蛋白酶的热稳定性的研究已取得了许多进展，Imanaka等提出一种通过定点突变增加蛋白酶热稳定性的策略，他比较了来源于Bacillusstearothermophilus耐热蛋白酶和Bacillusthermoproteolyticus的更耐热的蛋白酶的氨基酸序列及高级结构，确定了可能进一步提高Bacillusstearothermophilus耐热性的氨基酸残基，Gly144位于a-螺旋中，将它替换成Ala（M1突变）后预期能提高α-螺旋的疏水性和稳定性，从而提高其耐热性，反之，Thr66替换成Ser（M3突变）后则预期降低其耐热性，试验结果完全证实了这一设想。Yamashita等利用从一种毛霉Mucorpusillus中得到的Asp蛋白酶MPR为材料，将Ala101用Thr替换，Asp替换Gly186，然后，将突变的基因在酿酒酵母Saccharomycescerevisiae中表达。结果表明，这两种突变，特别是Gly186处的突变造成酶的耐热性显著下降，如果让这两个突变发生在同一个分子上，酶的热稳定性进一步下降。以上这些研究虽然还处于实验室研究阶段，但一正一反两个例子充分说明了利用这种方法提高饲料用酶的耐热性在理论上的可行性。 许多微生物产生的胞外酶都是糖基化酶，寡聚糖与酶以N-糖基化或O-糖基化形式共价连接，也有一些是以非共价形式连接能够通过各种物理方法将其分离。对于这些与胞外蛋白酶连接的寡聚糖，一般认为在分泌到细胞外的过程中可以保护酶受免疫蛋白酶水解及增强酶的可逆性，Tsujita从A.oryzea分离到一种酸性蛋白酶A1，A1又可以分离成两个组分A1a和A1b，每一个组分的糖基化比例都是50%，试验表明糖基化的酶对50%柠檬酸的变性作用有抵抗能力。根据这一特点，通过选择不同的表达系统使酶的糖基化程度和类型改变，也可达到改善蛋白酶的性质。 淀粉酶研究进展 淀粉一般是由直链淀粉和支链淀粉组成。主要用于饲料工业的淀粉酶有a-淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶。支链淀粉酶的特点是，能专一性的切开支链淀粉和糖原等分支点的a1-6糖苷键，形成直链淀粉。所以将该酶与其他淀粉酶配合使用，可使淀粉完全糖化。微生物中产生支链淀粉酶的菌种非常广泛，最早发现的是酵母菌，此外细菌如假单胞菌、芽孢杆菌、固氮菌以及某些放线菌。近年来支链淀粉酶作为淀粉酶中的一个新品种应用于饲料工业和食品工业。目前饲料中的主要成分是玉米，其中支链淀粉难以利用，造成饲料的浪费。如添加一定的支链淀粉酶，再在动物内源和外源淀粉酶的作用下，就能很好的消化吸收，提高饲料利用率，降低成本。 由于饲料加工过程中的高温阶段及饲料中淀粉酶的主要作用场所为动物呈酸性的胃肠道，因此使得饲料用淀粉酶的基因工程改良研究与其他饲料用酶制剂一样主要集中在酶的耐热性与酸稳定性上。通过多年的努力，这一研究已经取得了一定进展。 从80年代起，许多淀粉酶的研究工作集中在酶热失活的机理上。导致a-淀粉酶热失活的原因主要有两种。

第一种是高温使得蛋白分子的构象发生变化，分子的有序结构变为杂乱无章。在pH为5.0、6.0、8.0，当温度升高到90℃时，解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens中的α-淀粉酶会不可逆的失活，但当pH8.0时，若淀粉存在，可抑制酶失活。

第二种也是更主要的一种原因就是在高温下，Glu或Asp残基会发生脱酰胺作用从而导致酶活性丧失，如地芽孢杆菌中a-淀粉酶热失活的原因主要就是Glu或Asp的脱酰胺作用。与中温酶相比，高温酶具有额外的由2~3个特定Lys残基构成的盐桥。DNA重组技术为获得热稳定的淀粉酶提供了新思路。如嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）a-淀粉酶分子中第88位和第253位氨基酸残基被Lys和/或Arg取代，可提高酶在高温下的半衰期。

同样，当解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶分子中的第88、253和385位氨基酸残基被Lys或Arg取代，其热稳定性也有所提高。 1999年，美国Mitchinson等人发表了一项专利，对a-淀粉酶的耐温性和耐酸性进行了改良。研究的目的基因来源于地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）NCIB8061的a-淀粉酶编码基因。利用基因突变技术，他们改变了酶的性质。突变主要包括三种：一种为188位Asn的定点突变；第二种为188位Asn及15位Met同时被其他氨基酸所替代；

第三种突变不仅包括前两种氨基酸替代，还有其他位点的氨基酸替代。目的基因经过定点突变后被转化入受体菌--枯草芽孢杆菌中。研究发现，受体菌分泌的重组a-淀粉酶与原菌株表达的a-淀粉酶有耐温性、耐酸性和有效性方面都得到了改良。例如，M15T/N188S突变的a-淀粉酶的活性较原始酶分别提高了2.1倍（可溶性底物）和1.7倍（淀粉底物）。M15T/H133Y/N188S三点突变的a-淀粉酶比活性提高了2.8倍；与原始a-淀粉酶相比，M15T/N188S突变的a-淀粉酶在酸性条件下具有更高的酶活性，当pH值下降到5.2时，原始酶已无活性，但突变a-淀粉酶仍然具有活性；突变酶降低了酶对Ca2+的依赖性等。突变a-淀粉酶这些性质提高了a-淀粉酶在饲料中应用的有效性，为饲料用淀粉酶的基因工程改良提供了新的思路。 

构建杂合基因也是一种有效的改良淀粉酶性质的方法，如Shibuya将来源于A.shirousamii的a-淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因杂合在一起，在酿酒酵母中表达出一个145kDa大的双功能的融合蛋白，它同时具有a-淀粉酶活性和葡萄糖淀粉酶活性，大大提高了酶降解淀粉的有效性，但表达量仅有2.3mg/L。

同年，Shibuya等将此杂合基因在米曲霉中表达，将表达量提高到500mg/L，比在酿酒酵母中的表达量提高了200倍。 虽然通过基因工程对淀粉酶进行改良的大部分工作还处于实验室阶段，但其潜力已被科学家们所认可。 随着人们生活水平的提高及环境意识的增强，饲用酶制剂以其不产生残留、无抗药性、不污染环境等优势将会进一步被推广应用。饲用酶制剂既能提高饲料的消化率和利用率，提高禽畜及鱼类的生产性能，又能减少禽畜排泄物中的氮、磷的排泄量，保护水体和土壤免受污染。当然，饲用酶制剂在研究及生产中的普遍应用还面临着许多问题，我国政府也正积极通过禁止在饲料中使用抗生素、激素等方式来保障饲料和安全，维护生态平衡。但随着生物技术特别是基因工程技术和生产技术的提高，都将逐步解决。因而饲用酶制剂作为高效、无毒副作用和环保型的"绿色"饲料添加剂，在21世纪将有着十分广阔的应用前景。