首次在新的临床试验中进行体内人基因组编辑测试

　　科学家们之前已编辑过人基因组，但总是在体外的细胞中开展的。如今，作为一家生物技术公司，Sangamo治疗公司（Sangamo Therapeutics，以下称Sangamo）正在招募参与者参加几项临床试验：血友病B、赫勒综合征（Hurler syndrome）或亨特综合征（Hunter syndrome）患者具有非功能性的酶，通过锌指核酸酶（ZFN）在他们的基因组上产生双链DNA断裂，将编码功能性酶的基因插入到他们的基因组上。

　　Sangamo公司总裁兼首席执行官Sandy Macrae告诉《科学家》杂志，“这是首次一个人可能在其肝脏中具有一种新的基因。开展这些临床试验是一种荣幸，也是一种责任。”

　　Sangamo公司将重点关注的疾病之一是血友病B，它是由F9基因存在缺陷或缺失导致的一种严重的出血性疾病。这个基因的蛋白产物，即凝血因子IX，是血液凝结所必不可少的一种酶。

　　两种其他的临床试验将着重关注赫勒综合征和亨特综合征。这两种疾病的患者缺乏两种不同基因的一种功能性拷贝。这两种基因编码降解参与发育、血管生成等过程的复杂多糖的酶。若没有这些酶，被称作糖胺聚糖（glycosaminoglycan）的特定多糖类型在细胞中堆积，这能够导致神经问题、心血管疾病和其他症状。

　　在所有的这三项临床试验中，ZFN在人肝细胞中的白蛋白编码基因的靶位点上进行切割，随后这种基因的一种功能性拷贝通过同源重组而被整合到肝细胞的基因组中。

　　一项临床试验的初步阶段涉及6名血友病B患者，这些患者每个将接受低剂量、中剂量或高剂量SB-FIX药物静脉注射，这种药物由三种腺相关病毒（AAV）组成：两种AAV含有产生ZFN的基因，第三种AAV含有功能性的F9基因。

　　Macrae说，研究人员期待F9 DNA将被整合到少量肝细胞中的白蛋白编码基因的靶位点上，但是鉴于白蛋白在肝脏中高度表达，这些患者的凝血因子IX水平仍然能够增加。一旦Sangamo公司评估了这种药物的安全性和确定了它的最佳剂量，还有三名血友病B患者将作为最佳剂量组的一部分参加这项临床试验。

　　美国圣裘德儿童研究医院儿科外科医生Andrew Davidoff说，血友病B是“第一种能够靶向的疾病，这是因为这种疾病生理学特征是非常明确的”。他解释道，“如果你仅是替换这种缺失的或缺陷性的凝血因子，那么你将实际上治愈这些患者。”

　　Davidoff没有参与Sangamo公司即将开展的临床试验，但是他已领导了血友病B男性患者的临床试验：AAV病毒将F9的一种功能性拷贝运送到肝脏中。在Davidoff的临床试验中，这个基因盒并没有整合到病人的基因组中，而是作为被称作附加体（episome）的基因组外DNA存在于肝细胞中。Davidoff解释道，“鉴于没有整合，如果靶细胞发生分裂，那么就可能丢失这些附加体。”

　　但是，即便F9没有整合到基因组中，在Davidoff的临床试验中接受这种治疗的这些男性患者仍然增加表达这种凝血因子，从而导致临床症状改善。这些最早的参与者已在7年多的时间内表现出一致性的循环凝血因子IX水平。Davidoff说，“有些令人吃惊的是，情况一直很稳定。答案的一部分在于在没有创伤或外科手术的情形下，肝细胞很少发生分裂。”

　　Macrae说，在当前的临床试验中，Sangamo策略的一种优势在于它是“一种终生解决方案”。一旦这些ZFN促进F9基因的功能性拷贝整合到参与者的肝细胞基因组中，该基因就应当稳定地表达。

　　美国南加州大学凯克医学院基因疗法研究员Paula Cannon将这种白蛋白编码基因描述为一种“安全港位点”---通过实验确定适合基因插入和长期表达的基因组位点。Cannon并未参与当前的这些临床试验，但是她之前与Sangamo公司合作利用ZFN将一种基因整合到人细胞中，从而使得这些细胞的后代抵抗HIV感染。

　　Cannon 告诉《科学家》杂志，ZFN和CRISPR/Cas9基因组编辑系统都能够以一种位点特异性的方式切割DNA，但是她补充道，在开发临床疗法时，ZFN也存在优势。比如，CRISPR/Cas9存在一些限制，也就是，结合到靶序列上的向导RNA（gRNA）必须附着到一个锚定序列（通常含有两个G碱基）上。她说，因此CRISPR/Cas9“并不会提供你想要的高度特异性。”

　　Cannon补充道，“ZFN有点较难以开发”，但是Sangamo公司开发的系统“给你提供非常特异性的和高度有效的ZFN。他们能够让ZFN切割任何一种特定的碱基。”

　　Cannon强调的ZFN的另一种优势是它们的历史和被美国食品药品管理局（FDA）批准作为试验性新药。ZFN已成功地被用来敲除一种参与HIV入侵人T细胞的基因，而且当被注射到人体中时，这些细胞并没有引发免疫反应。

　　ZFN的另一种益处在于它们比Cas9小，而Cas9是CRISPR/Cas9系统所必需的。Cannon说，“当在体外编辑细胞时，这并不重要。但是如果你想在体内处理组织，正如当前的这项临床试验那样，那么你会研究一类被称作AAV的载体。真地很难将Cas9插入到这类载体中，这是因为它太大了。”

　　但是，体内基因组编辑的一些障碍是普遍存在的。美国宾夕法尼亚大学医学院病理学家Robert Doms（未参与当前的这些临床试验）说，“不论使用ZFN或者类似的TALEN或CRISPR/Cas9系统，它们都存在运送问题，也就是如何将感兴趣的产物运送到特定的细胞而不是其他的细胞中。不论尝试着做什么，这都是基因疗法面临着的一项挑战。”

　　针对Sangamo公司当前的临床试验而言，将这些药物中的任何一种运送到肝脏中是相当简单的，这是因为AAV很容易经过血液入侵肝细胞。Macrae解释道，其他的研究团队已成功地将AAV运送到眼睛中，而且Sangamo公司可能很快对AAV到大脑中的运送进行优化。但是他同意将药物运送到合适的组织中是一个迫在眉睫的问题。他说，“我相信未来使用和编辑应用的秘密在于运送。”