从大鼠肝脏中分离高尔基复合体
从培养的哺乳动物细胞中分离高尔基体
从植物组织中分离高尔基体
| 实验材料 | 雄大鼠 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 匀浆缓冲液 |
| 仪器、耗材 | Polytron 匀浆器 |
| 实验步骤 | 1. 将按要求进用标准食物和饮水的雄大鼠（约 250 g) ，用断头和放血的方法处死。 2. 切下肝脏（10~13 g ) 并用刀片切碎。 3. 用一只 Polytron 匀浆器（20 ST 或 10 ST；Brinkman lnslruments) 以 10000 r/min 的频率将每份肝脏在 2 倍体积的匀浆介质中处理 40 秒钟。 匀浆缓冲液： 50 mmol/L Tris -马来酸（Tris-maleate)，pH 6.4 0.5 mol/L 蔗糖 1% 葡聚糖（Sigma，平均分子量 225000） 4. 将匀浆液于 5000 g 离心 15 分钟，去除大部分上淸，用一只装有橡胶球的大孔巴斯德吸管（内径约 1 mm ) 将沉淀中黄褐色的部分（上部 1/3 ) 重悬于少量的上清中。 5. 用吸管将悬液吹吸大约 12 次使之混匀，将悬液铺在 1.2 mol/L 蔗糖之上。  6. 在一只吊篮式转头（Spinco SW50.1 ) 中将管子于 100000 g 离心 30 分钟。 7. 用一只巴斯德吸管将上清吸出，然后用一只装有橡胶气球的巴斯德吸管将高尔基体的 “毯子”从 1.2 mol/L 蔗糖层上挑起。 8. 将这部分高尔基体悬于以下中的一种： (1) 来自蔗糖梯度的清亮上清，适于最佳形态的保持。 (2) 蒸馏水用于达到最高的分部纯度。 (3) 匀浆介质或酶分析混合液（cocktail) 用于保持酶的活性。 9. 以 5000 g 离心 15~20 分钟收集高尔基体。 |
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