高效液相色谱法的主要类型和分离原理

　　根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：

　　1 .液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)

　　流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶(极性不同，避免固定液流失)，有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：

　　式中，cs—溶质在固定相中浓度;cm--溶质在流动相中的浓度; Vs—固定相的体积;Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大;但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。

　　a.正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography):流动相的极性小于固定液的极性。

　　b.反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography):流动相的极性大于固定液的极性。

　　c.液—液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解;流动相通过拾步便民新昌色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相(见后)，可克服上述缺点。现在应用很广泛(70~80%)。

　　2 .液—固色谱法

　　流动相为液体，固定相为吸附剂(如硅胶、氧化铝等)。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子(X)和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附(未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S)，可表示如下：

　　Xm + nSa ====== Xa + nSm

　　式中：Xm--流动相中的溶质分子;Sa--固定相中的溶剂分子;Xa--固定相中的溶质分子;Sm--流动相中的溶剂分子。

　　当吸附竞争反应达平衡时：

　　K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

　　式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]

　　3 .离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)

　　IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

　　以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：

　　X-(溶剂中)+(树脂-R4N+Cl-)===(树脂-R4N+ X-)+ Cl-(溶剂中)

　　当交换达平衡时：

　　KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

　　分配系数为：

　　DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]

　　[讨论：DX与保留值的关系]

　　凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。

　　4 .离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)

　　离子对色谱法是将一种(或多种)与溶质分子电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：

　　X+水相+ Y-水相=== X+Y-有机相

　　式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子(也可是阳离子);Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对(如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等);X+Y---形成的离子对化合物。

　　当达平衡时：

　　KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相

　　根据定义，分配系数为：

　　DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

　　[讨论：DX与保留值的关系]

　　离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。

　　5 .离子色谱法(Ion Chromatography)

　　用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。

　　以阴离子交换树脂(R-OH)作固定相，分离阴离子(如Br-)为例。当待测阴离子Br-随流动相(NaOH)进入色谱柱时，发生如下交换反应(洗脱反应为交换反应的逆过程)：

　　抑制柱上发生的反应：

　　R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

　　R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

　　可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响;试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏的检测。

　　离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。

　　6 .空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)

　　空间排阻色谱法以凝胶(gel)为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。