高效液相色谱法测定红霉素眼膏的含量的探讨

　　红霉素眼膏系由红霉素和眼膏基质加工制成的外用抗菌素，是目前临床常用于沙眼、结膜炎、角膜炎、眼脸缘炎及眼外部感染。中国药典2000年版采用抗生素微生物检定法测定其含量，该方法周期长，操作繁琐，影响因素较多。本文介绍的高效液相色谱法，采用优化的色谱条件，使红霉素眼膏的含量测定操作简便，专属性高，重现性好，可以替代微生物检定法。

　　1仪器与试药

　　AgilentLC1100高效液相色谱仪，AgilentLC1100自动进器，AgilentLC1100紫外检测器，依利特色谱柱（大连依利特科学仪器有限公司，填料：sinochromODS-BP5um；4.6mm×250mm），AgilentLC1100数据处理仪。

　　红霉素对照品由中国药品生物制品检定所（批号：0307－9713）；红霉素眼膏三批（批号041103、050202、050601），规格2g：0.5%；眼膏基质均由新乡恒久远药业有限公司提供；乙腈为色谱纯；磷酸二氢铵、三乙胺为分析纯；水为超纯水。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件固定相：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：0.1mol/L磷酸二氢铵溶液（三乙胺调节pH6.5）-乙腈（70：30）；流速1.0ml/min；检测波长210nm；进样量20ul。在上述条件下，测得红霉素对照品溶液色谱图，红霉素的保留时间约为6.3分钟，与杂质峰的分离度均大于1.5。

　　2.2对照品溶液的制备精密称取红霉素对照品320mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，配成对照品贮备液，再精密量取2ml置25ml量瓶中，加流动相配制成每1ml含红霉素0.5mg的对照品溶液。

　　2.3供试品溶液的制备精密称取样品10g，置分液漏斗中，加石油醚80ml，缓缓振摇，使基质溶解，用磷酸盐缓冲液（pH6.5）提取4次，每次约25ml，合并提取液，置100ml量瓶中，用磷酸盐缓冲液（pH6.5）稀释至刻度，摇匀，配制成每1ml含红霉素0.5mg的供试品溶液。

　　2.4线性关系分别精密量取上述对照品贮备液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0ml至25ml量瓶中，加流动相至刻度。分别进样20ul，记录色谱图。以峰面积（Y）对进样量（X）绘制标准曲线，回归方程为：Y=32798+95934Xr=0.9999。结果表明，红霉素在进样量2.5～80ug的范围内，峰面积与进样量之间呈良好的线性关系。

　　2.5阴性对照溶液试验按处方（除红霉素外）配制阴性样品，照“2.3”项下操作，即得空白溶液，在上述色谱条件下，进样20ul。记录色谱图，见图1。

　　2.6精密度试验取试验用对照品溶液,重复进样5次，记录色谱峰面积，RSD为0.55%。

　　2.7溶液稳定性取试验用供试品溶液在室温放置，分别于0、1、3、5小时取20ul进样，记录色谱峰面积，RSD为0.13%。

　　2.8回收率试验分别称取按处方比例的基质约4.95g，称取9份，分别精密加入红霉素对准品40mg，50mg，60mg，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依上述色谱条件测定，计算回收率。

　　2.9样品测定取样品3批，按“2.3”项下方法制备供试品溶液；另精密称取红霉素对照品适量，按“2.2”项下方法制备对照品溶液；精密量取对照品和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算出供试品中红霉素的含量，并与中国药典2000年版收载的微生物检定法进行比较，结果见表2。

　　3讨论

　　3.1检测波长的选择:取红霉素对照品用流动相溶解并制成每1ml中含0.5mg的溶液，在190nm～300nm的波长范围内扫描，在210nm的波长处有最大吸收，因此选择210nm为检测波长。

　　3.2流动相的选择:在实验过程中，选择不同盐浓度和不同pH值的流动相进行比较，发现盐浓度的增加可改善红霉素与有关物质的分离度，流动相pH值的提高也可改善红霉素与有关物质的分离度，考虑到对色谱柱的损耗，故选用0.1mol/L磷酸二氢铵溶液（三乙胺调节pH6.5）?乙腈（70：30）作为流动相。

　　3.3用HPLC法测定红霉素的含量，准确性及重现性均较好，且操作简便，HPLC法与微生物检定法进行比较，测定结果基本一致（见表2），因此可以用HPLC法替代微生物检定法测定红霉素含量。