1.2 植物材料
1.2.1 水稻秧苗。将1.6-mL 96方孔板底部用6 mm电钻头打穿，或将旧96孔PCR板的底部剪去约4 mm。使用时将方孔板压入少量泥巴。每孔放入1粒萌动的水稻种子，在自然日光下(或人工气候箱)生长至3~4片叶。其他植物小苗也可用类似方法种植。
1.2.2 水稻大植株的鲜叶片或干燥叶片。
1.2.3 其他单子叶和双子叶植物的鲜叶片或干燥叶片。
1.3 操作方法
1.3.1 鲜叶片基因组模板DNA的制备
(1) 用手摘取水稻秧苗叶一小段(对大植株的叶片，避开主叶脉撕取约3 mm宽的一小段)，放入2.2-mL或1.6-mL的96方孔板的孔中，叶片长度与方孔板深度大致相同，对其他单子叶植物叶片的操作与对水稻相同，双子叶植物叶片量为2~4 mg(不要太多)。
2.2-mL或1.6-mL的96方孔板孔深分别为42 mm和27 mm，摘取的叶片放进去后与孔口差不多齐平。这样做的好处是震动打叶片过程中叶片顶端被盖压着不会往上跳，而下部约8 mm以下部位(约2~3 mg)才能被打碎。只摘约6~10 mm(2~4 mg)叶片段放入孔中也行，但在震动过程中会有叶片跳到孔壁上粘着而打不着的现象(震动时珠子也只在孔下部作用)。不要将叶片摘成多个小段放入一个孔中，这样不仅费时，更主要的是会过量打碎叶片而抑制PCR(被打碎的叶片不要超过10 mg 150 µL-1溶液，见下文和图2)。
2.2-mL方孔板比1.6-mL方孔板的孔深，溶液不易弹到盖子上，可减少交叉污染的机会。也可用96孔PCR板，但容易卡住钨合金珠。
(2) 每个孔投入1粒钨合金珠或不锈钢珠(钨合金珠比重大效果较好)。不推荐使用普通钢珠，因用过的钢珠会生锈，铁锈会抑制Taq酶活性。用多通道移液器加入150 µL 1´制备缓冲液，也可以用去离子水或0.5 ´ TE，但对DNA保存的稳定性不如用此缓冲液。盖好硅橡胶盖(可铺上1张保鲜膜再盖硅胶盖，打完开盖后丢弃保鲜膜)。
(3) 用涡旋器振动3~5 min(如果是放入约6~10 mm长度的叶片，叶片跳到孔壁上会被粘着，因此期间要在桌面拍打96孔板几次，使粘在孔壁上的叶片落回底部)；或在MTM-96研磨器(设强度为中上)振动3 min。从底部往上看，可见溶液变浅绿色。
(4) 用吊篮转子离心机离心约10 s(如没有此种离心机可省略此步骤)。
(5) 直接用作PCR模板(1.3.3)。
1.3.2 干叶片基因组模板DNA的制备
(1) 用剪刀将干叶片剪成约2~3 mm小段，放约2~3 mg到96方孔板的孔中(初次实验用分析天平检验用量的适合度，日常操作以经验目测即可)。
(2) 每个孔投入1粒钨合金珠，盖好硅橡胶盖。放入液氮箱冻几分钟。
(3) 用涡旋器(或MTM-96多功能研磨器)振动约2~3 min。放入有液氮的盒子内冻约30 s，再振动约2 min。
(4) 离心约30 s，以便使粘在壁和盖上的叶片粉末落回底部。
(5) 打开盖子，用多通道移液器加入150 µL 1´制备缓冲溶液，盖好硅橡胶盖。
(6) 用涡旋器(或MTM-96多功能研磨器)振动3~5 min。
(7) 将96方孔板置约90℃水浴加热约5 min。离心约1 min。
1.3.3 PCR反应
(1) 分子标记检测用每块96孔PCR板，配制PCR液1600 µL，含上海申能博彩公司产Taq酶45 U (每35 µL反应液为1 U), 100~150 µmol L-1 dNTPs，PCR引物各约0.25 µmol L-1。如果2个标记的产物长度不重叠，可以在同一个反应里做2个标记的扩增(见图3-C)。用多通道移液器往96孔PCR板每孔分入15 µL。扩增较大片段DNA(>1 kb)时，反应体积为20~25 µL，0.8~1 U Taq酶。
(2) 用96针复制器沾取约0.5~1 µL上述的gDNA溶液转移到PCR反应液。用过的96针复制器要马上泡在水中及时清洗。如果没有96针复制器，可用多通道移液器加约1 µL模板DNA，不要加入超过1.5 µL gDNA溶液，以免降低PCR的效率。
(3) 如果需要保存模板DNA溶液一段时间，用强磁铁吸出合金珠,将样品放在20℃保存备用。
(4) 根据引物的具体情况和扩增片段的长度设定合适的PCR条件(设预变性95℃ 1 min)。一般分子标记引物(18~22 nt)的扩增用32~35循环。按常规的聚丙酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
(5) 将用过的96方孔板洗干净，可多次重复使用。
我们在检测共显性基因型(即长度多态)标记的gDNA样品中混入少于1/50量的另一种基因型DNA样品为模板进行测试，表明不会影响PCR产物的目的基因型的正确检测（结果未显示）。而用过的96孔板的残留gDNA量在新配制的gDNA中的比例远远低于1/100，因此不用担心重复使用96方孔板和96针复制器残留痕量基因组DNA的污染对后续试验的影响。但对于检测阳性/阴性样品的标记(即PCR产物的有/无，如转基因的有/无)，在阴性的样品DNA中污染痕量的阳性样品就可能产生PCR假阳性，因此对这类标记不要重复使用制备过gDNA的96孔板。
2 结果与分析
2.1 对制备gDNA浓度的测定
本方法制备的植物gDNA溶液未经纯化，含有RNA、蛋白质和叶绿素等杂质，因此不能用分光光度计测定其浓度。将制备的gDNA在琼脂糖凝胶上电泳也由于DNA浓度低且呈涂抹状而难以估计其浓度(结果未显示)。为了较准确测定该浓度，将纯化定量的籼稻品种93-11的gDNA梯度系列(0.5~8 ng，作为内参)和1 µL本方法制备的粳稻(02428)gDNA混合，用1个InDel标记引物进行PCR扩增和PAGE检测。结果表明，4个测试样品(每个样品2~3 mg叶片，加入150 µL溶液)制备的gDNA浓度为2~3 ng µL-1(图1)。
图1 用InDel标记PCR估算所制备的水稻基因组DNA浓度
Fig. 1 Estimation of concentrations of the prepared rice genomic DNA samples by PCR with an InDel marker
