默克Amnis量化成像流式细胞仪在纳米药物研究中的应用

　　ImageStream技术建立在传统的流式细胞术基础之上，结合了荧光显微成像技术，它具有多个检测通道，可以对通过流动室中的每个细胞进行成像，实现了对细胞图像进行多参数量化分析，获得全新的细胞形态统计学数据。ImageStream系统配有功能强大的数据分析软件IDEAS，可以对每个细胞分析超过500种量化参数。这些参数不仅包括细胞整体的散射光和荧光信号强度，还包括对细胞形态，细胞结构及亚细胞信号分布的分析。从2005年开始，Amnis量化成像流式分析仪被广泛应用于生物化学、药物研发、血液、免疫、微生物、海洋、肿瘤、寄生虫、干细胞、毒理、病毒等各个领域。随着ImageStream高速显微成像流式细胞技术的发展成熟，越来越多的科研人员开始将这种革命性的技术手段运用到自身的研究领域，并发表了大量有影响力的论文。

　　图1. 默克Amnis量化成像流式细胞仪

　　纳米技术对多项高新技术的产生和发展都产生了极为深远的影响，特别是在药物研发领域。纳米技术对于药物研发的影响主要体现在：第一，革新药物生产过程，改善生产工艺，降低成本提高效率；第二，显着提升药物的作用效果和靶向性，在改善治疗效果的同时降低药物毒副作用对机体的影响。例如，纳米药物载体能调节释药速度，改变药物在体内的分布；提高药物溶解度和生物利用度；使药物准确到达靶向部位，减少药物毒副作用。另据报道，纳米药物载体能使中药的靶向性得到数百万倍的提高，从而更精准地到达病变区域，产生更好的治疗效果。纳米药物因其巨大的发展前景，受到各国的高度重视。

　　美国已有超过20种纳米药物进入各期临床实验。而我国也已启动纳米973计划，目标直指具有自主知识产权的纳米新药。时至今日纳米药物的研究已经成为现代医学发展和药物创新的重要方向，在预防与控制癌症等重大疾病研究领域都有望取得重要突破，极有可能在不远的将来释放巨大的经济和社会效益。

　　纳米药物虽然是具有巨大发展前景的新型药物，但由于发展的时间很短，纳米药物的基础理论及纳米级制剂的生产工艺等还很不完善，特别是纳米药物在临床应用中的生物机制，以及纳米药物作用的细胞模型都非常欠缺，亟需发展。纳米毒理学，纳米药物动力学，纳米药物结构优化和功能测定都亟需具备高通量和高内涵性能的新型细胞学水平研究工具。量化成像分析流式细胞仪以其高通量的数据获取能力和量化成像分析能力很好地满足了纳米药物的研究需求，为许多已经发表重要的高水平工作提供了关键性的数据，引起业内同行的高度重视。

　　量化成像流式细胞仪对纳米材料的研究主要有两种方式。一种是通过衡量纳米药物在细胞内部的荧光来判断纳米药物在细胞内的摄入程度，即内化值，内化值越大，表示细胞内部摄入的纳米药物越多；第二种是通过计算细胞内部所摄入的纳米药物荧光点的数目来衡量纳米药物的摄入程度。

　　图2. 分析纳米颗粒是否进入细胞的两种方法，一是通过内化参数Internalization来实现的，它代表的是外源信号在细胞以内存在的情况。该参数能够在单个细胞以及整个细胞群体水平衡量纳米载体或纳米颗粒进入细胞的程度。二是统计细胞内的纳米颗粒数量，是通过计点参数，即Spot Count Feature来完成。能够统计在每个细胞范围内，有多少个纳米颗粒形成的小点，能反映纳米颗粒进入细胞的效率。

　　近期发表在Acta Biomaterialia的文献“A high-throughput bioimaging study to assess the impact of chitosanbased nanoparticle degradation on DNA delivery performance”一文综合运用Amnis成像流式细胞仪对基于三甲基壳聚糖 (TMC)的纳米颗粒（NPs）的生物学特性进行了研究。研究者们对基于三甲基壳聚糖的纳米颗粒(TMC-NPs)研究了不同程度（从4%-21%不等）的乙酰化修饰，发现14%的乙酰化修饰可使纳米颗粒的转染效率最高。在这篇文献中，研究者综合运用Amnis成像流式研究了1：TMC-NPs进入细胞的内化时间曲线；2：对每个时间点进入细胞的纳米颗粒数目进行自动统计；3：研究了纳米药物进入细胞内的位置定位；4：纳米药物对细胞造成的凋亡。这篇文章对于做纳米药物的研究者提供了有力的证据，利用Imagestream成像流式可以大大增加纳米药物的研发能力。

　　图3.通过成像流式研究内化的时间曲线。(a)使用ImageStream获取的明场视野下、YOYO-1（pDNA）和叠加的细胞图像（标尺：10 um）。面罩分别用来计算全细胞（1），细胞质（2），和细胞膜（3=1-2）。YOYO-1图像来代表在细胞质的区域，来区分内化的纳米颗粒和位于细胞膜上的纳米颗粒。(b)与CH(原始壳聚糖)或TMC-NPs孵育0.5-24小时后的YOYO-1阳性的ND7/23细胞比例。显示出有NPs的细胞与内化了NPs的细胞的差别；（c）从0.5-24小时，NPs的时间曲线显示出内化值的升高。

　　图4：每个细胞的纳米粒子囊泡 (NLV) 数随孵育时间的量化。（a）从成像流式细胞仪 （明场）观察到细胞中越来越多的 NLV (YOYO-1：绿色；标尺：10 um)。（b） 直方图 NLV 频数分布图。被认为低 (c)、 中等 (d) 和高 (e) NLV的数目的细胞的比例。（f） 24小时的NPs NLV 数目的分布表。

　　图5.在细胞核附近出现纳米粒子囊泡 (NLV)的细胞百分比的测定。（a） 获得的成像流式细胞仪的图像。使用 480-560 nm (YOYO-1：绿色) 和 660-740 nm 的荧光通道采集 (DRAQ5-红色) (标尺：10 um)。（b）选择双阳性细胞圈门；（c）YOYO-1与细胞核共定位的计算；（d）与 CH或TMC-NPs 孵化24 小时后细胞核附近NLV 阳性细胞百分比。

　　图6.ND7/23 与 CH 或 TMC-NPs孵育后的细胞凋亡。（a）非凋亡和凋亡细胞圈门，以及代表图像：明场和核区域 (DRAQ：红色荧光) (标尺：10um)；（b） 细胞凋亡的百分比。