(1)温育时间：ME花环百分率随温育时间延长而逐渐增加，温育1h，ME百分率为7.4±3.1%，而温育18h，增至18.3±3.8%，温育72h后，花环数又逐渐降至3.4±7.1%。
(2)培养液：以用Tc199培养液最为适宜，其结果及重复性均好。用Hepes缓冲的RPMl 1640培养液洗涤和重悬淋巴细胞和红细胞，导致细胞趋向聚集，而形成大块细胞，从而产生不可靠的结果。
(3)红细胞与淋巴细胞的最适比例约为35∶1，比例>60∶1，或比例<25∶1时，ME花环数可减低。
(4)保存MRBC的培养液：在Alsever液中，MRBC 4℃保存1周仍可产生稳定的花环数，而在PBS，生理盐水或Tc199培养液中保存的MRBC，随着保存时间延长，花环数逐渐下降，保存72h后，只能看到小数花环或无花环形成细胞。