干细胞研究鼻祖分享经验：如何分选干细胞

　　最早研究人员是在1997年发现了急性髓系白血病（AML）血液样品中的癌症干细胞，但是由于采用表面标记物证明实体肿瘤中癌症干细胞的存在，常常会出现不一致的结果，因此这一理论也引发了激烈的讨论。但是近年来科学家们在所有癌症类型（胶质母细胞瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌）中发现了具有自我更新能力，启动肿瘤发生的细胞，因此讨论不再围绕着“癌症干细胞是否存在？”了，而是变成了“癌症干细胞的类型有多少种？”

　　要想了解癌症干细胞并不容易，其中一大阻碍就是癌症干细胞的获得，许多医院会对肿瘤样品进行冷冻切片，而要从解冻组织中获得可用的细胞就没有从新鲜样品中取样那么简单了。另外一个问题在于根据细胞表面标记分离高纯度的细胞群。近期The Scientist杂志找到了一些专家，请教了他们在这些方面的经验。

　　通过流式细胞仪分选干细胞

　　斯坦福大学的干细胞生物学与再生医学研究院主任Irving L. Weissma教授是世界顶级的生物医药科学家，免疫学、癌生物学、干细胞、肿瘤免疫和细胞治疗等领域的权威，美国国家科学院和国家医科院两院院士，文理科学院院士。他曾在世界上最早发现、分离和纯化造血干细胞，并成功用于癌的细胞移植治疗，被誉为“干细胞科学的鼻祖”。

　　癌症干细胞通常是通过细胞表面的标记物进行识别，并利用荧光共轭的抗体进行染色（现下设计出了靶向不同标记物的不同颜色荧光试剂），这样流式细胞仪就能从悬浮液中检测到这些荧光细胞。虽然目前许多染色指南采用的是单克隆抗体，但是一些小心的研究人员还会加上一个封闭步骤，用以阻止抗体识别出假阳性。

　　Weissma教授建议道，仅仅采用一种标记物分离AML干细胞并不够，这个由正常造血干细胞分化成AML癌细胞的过程我们了解的比较多了，因此应该进行最具特异性的标记进行分离。Weissma教授建议从AML干细胞群中要分离出CD34+，CD38-，CD90+，和Lin-细胞群。

　　对于实体肿瘤，专家则指出研究人员需要先对目标癌症的干细胞文献非常了解熟悉，虽然研究已经发现Lgr5 能标记结肠癌肿瘤干细胞，但细胞表面的Lgr5 表达一般较低，其它的标记，如EpCAM、CD44和CD166也已由多项实验证实，可以用于癌症干细胞分离（PNAS, 104:10158-63, 2007； J Clin Pathol, 65:140-45, 2012； Oncol Lett, 7:1544-48, 2014）。

　　来自斯坦福大学的Michael Clarke是首位从实体肿瘤中分离出癌症干细胞的科学家，他警告说虽然细胞表面的标记物可富集，但是这些标记物并不能确保分选出来的细胞就会发展成一个完整肿瘤——验证癌症干细胞的关键一步。由于实体肿瘤的癌症干细胞标记差异很大，因此研究人员需要通过移植实验对单个肿瘤的所有细胞类型进行检测。

　　“对于大多数人来说最棘手的就是分选，”Dove说，“流式细胞仪操作并不便宜，也不容易，研究人员如果没有经验就需要摸索各种阈值，校准和参数。而且更重要的是，利用抗体分离癌症干细胞会由于发射光谱重叠而造成紊乱，研究人员应该仔细分析实验中采用的每种单克隆抗体的用量，比较不同的荧光基团抗体组合效果，换句话说，这就是一个费时费力的优化过程。