JenniferDoudna：除了基因编辑，CRISPR还能做什么？

Jennifer A. Doudna（左）

　　很少有发现能够像CRISPR那样在一夜之间改变整个领域。CRISPR-Cas原本是原核生物的适应性免疫系统，自从人们发现了Cas9的应用潜力，这一系统迅速成为了炙手可热的基因组编辑工具。加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna在本期Molecular Cell杂志上发表文章，全面探讨了CRISPR-Cas9在各方面的应用。Doudna是CRISPR技术的共同开发者，曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”（Breakthrough Prize），也是CRISPRZL的有力竞争者。

　　CRISPR-Cas9基因组编辑

　　人们发现Cas9的分子功能之后，很快开始用Cas9和sgRNA编辑基因组。CRISPR-Cas9让以往费时费力的基因组编辑变成了一件非常容易的事。

　　引入插入/缺失

　　Cas9在sgRNA的引导下，靶标目的位点并诱导双链断裂DSB，细胞通过NHEJ（non-homologous end-joining）将其修复。NHEJ是一个容易出错的修复通路，会产生插入/缺失（indel）破坏开放阅读框，导致基因失活。CRISPR-Cas9在这方面的编辑效率可以高达80%。

　　精确的改变

　　HDR（homology-directed repair）可以让CRISPR-Cas9的基因组编辑更加精确。将Cas9-sgRNA与供体DNA结合起来，细胞就能用供体DNA作为模板来修复DSB。这一策略可以向目的基因引入新序列或者特定突变，模拟或者矫正致病性的等位基因。不过HDR的效率显著低于NHEJ。

　　染色体重排

　　用CRISPR-Cas9对模式生物进行基因组编辑已经常规化了，人们又发现了一些更有趣的应用。举例来说，同时表达Cas9和多种sgRNA可以实现多重化靶标。除了同时编辑多个染色体位点以外，CRISPR-Cas9还可以删除染色体大片段，这需要两个sgRNA在目标区域两侧诱导DSB。此外，CRISPR-Cas9还可以模拟肿瘤中发生的大规模的染色体重排。

　　CRISPR-Cas9高通量筛选

　　最近有不少研究利用CRISPR-Cas9的可编程特性进行全基因组筛选。比如说，用慢病毒sgRNA文库和催化活性的Cas9可以在人类和小鼠细胞中进行功能缺失的基因敲除筛选。这样的筛选可以揭示细胞生存的必需基因，以及涉及特定药物抗性的基因。

　　失去催化活性的Cas9 (dCas9)也可以用来进行全基因组筛选，它可以直接上调或者下调基因表达。与生成indel的活性Cas9相比，在某些情况下dCas9的转录沉默能够更有效的阻断基因表达。不过dCas9在这方面的最大优势是，介导转录激活子的招募，进行功能获得性筛选。

　　dCas9调控基因表达

　　通过点突变失活Cas9的催化活性位点，就会得到dCas9。dCas9依然可以在RNA的引导下，实现可编程的DNA结合。人们利用这一点开发了调控基因表达的新工具。

　　dCas9与sgRNA一起在细菌中表达，可以阻止RNA聚合酶与启动子结合，下调特定转录本的表达。人们还将dCas9与特定的效应子结构域融合起来，将转录抑制因子或转录激活因子招募到特定的基因组区域，在真核生物中实现更强的基因表达控制。除此之外，将dCas9与带有表观遗传学标签的效应子结构域融合，还可以特异性的干扰表观遗传学调控。

　　dCas9的其他用途

　　dCas9还有一些其它的用途：dCas9与GFP融合能够在活细胞中成像DNA位点，进一步揭示基因组特定位置的动态和结构。人们还可以通过dCas9介导的转录调控构建稳固的基因回路，这对于合成生物学来说非常实用。最近还有研究表明dCas9可以结合单链RNA，这意味着在不久的将来人们有望对RNA转录本进行编程操作。

　　提高CRISPR-Cas9特异性

　　为了减少CRISPR-Cas9的脱靶效应，人们开发了一系列策略。研究者们用成对的sgRNA引导Cas9切口酶变体，在sgRNA结合的地方造成单链切口（SSB），两个相邻的单链切口会形成一个DNA双链断裂（DSB）。而单个sgRNA造成的SSB能通过碱基切除修复得到精确修复，不引入插入或缺失突变。

　　研究者们还对Cas9进行了基因工程改造，让其依赖二聚化才能酶切，就像锌指核酸酶（ZFN）和TALEN那样。研究显示，dCas与Fok1核酸酶融合之后，DSB形成依赖于FokI的二聚化。二聚化酶对序列的要求更为严格，可以大大减少脱靶位点的数量。Cas9-FokI单体无法进行酶切。

　　人们还发现，适当截短sgRNA可以减少脱靶事件，同时不牺牲正确编辑的效率。只需要缩短gRNA靶标区域的长度，就可以使脱靶突变大幅减少。研究表明，17/18个核苷酸的靶向区域能够比全长gRNA更有效地靶向预定序列。

　　CRISPR-Cas9的未来

　　CRISPR-Cas9在医疗领域有着广阔的前景，可以用来矫正致病突变，治疗人类疾病。研究者们也在尝试用这一技术操纵生态群体，比如根据毒力或者抗性基因杀死相应的细菌、快速改变种群性状、控制入侵物种、改良主要农作物等等。此外，CRISPR-Cas9还有着很大的潜力，可以被改造为更强大的研究工具。Doudna指出，这一技术将带领生物学研究进入一个新的时代。