发布时间:2021-02-22 15:01 原文链接: 翟继先团队开发植物单细胞核全长RNA检测技术​

  近年来,高通量单细胞转录组测序已广泛应用于动物细胞研究,但只在少数植物物种和组织的研究中存在报道。其主要原因是因为植物细胞比动物多了一层细胞壁,使得植物单细胞RNA-seq必须先消化细胞壁并制备原生质体。而原生质体的制备对于许多组织都非常困难,且制备过程会影响细胞的转录状态而引入不必要的干扰。因此,一种无需原生质体化的方法对于单细胞测序技术在植物领域中更广泛的应用必不可少。

  2021年2月19日,南方科技大学生物系副教授翟继先团队在Genome biology杂志上发表了文章FlsnRNA-seq: protoplasting-free full-length single-nucleus RNA profiling in plants,开发了一种不经过原生质体直接检测植物单细胞核全长转录组测序方法。

  图片图1. FlsnRNA-seq流程图。首先,通过研磨的方法从组织样本中分离出细胞核,通过10x Genomics建库方案构建RNA文库,获得全长cDNA并进行扩增后,将DNA分成两半。一半用于常规的二代文库构建并Illumina测序,另一半用于Nanopore长片段测序。

  根据翟继先课题组之前对新生RNA全基因组水平的研究发现,细胞核中有大量已经多聚腺苷酸化的信使RNA依然与染色质相结合。那么细胞核中的RNA能否表征整个细胞的转录状态呢?此外,基于Illumina平台的二代单细胞测序往往只能捕获基因的表达丰度,那么与全长转录组测序技术相结合的单细胞全长测序能否利用RNA剪接、可变多聚腺苷酸化等导致的同源异构体信息来辅助细胞类型鉴定并挖掘出更多信息呢?

  为了回答这些问题,并突破原生质体的限制,优化植物单细胞测序技术,翟继先团队提出了基于细胞核测序的全长单细胞转录组测序方法FlsnRNA-seq(protoplasting-free full-length single-nucleus RNA profiling in plants)。此方法通过结合10x Genomics单细胞测序技术和三代全长Nanopore测序方法实现了单细胞核全长转录组测序。同时利用Illumina测序技术捕获表达丰度信息,并以Nanopore测序技术捕获同源异构体信息,从而最大限度地保留单个细胞核的转录状态(图1)。

  首先,作者分离了拟南芥根尖细胞核并验证了FlsnRNA-seq方法的有效性。二代测序方法得到的基因表达丰度信息可将捕获到的细胞核分为14个细胞簇。利用组织特异基因对这些细胞簇进行注释,鉴定到了10种主要细胞类型。将FlsnRNA-seq单核测序结果与已发表的单原生质体测序结果相比较发现,两种方法所获得的结果相似,说明植物细胞核可以取代原生质体进行单细胞转录组分析。此外,Nanopore文库所捕获的基因表达丰度矩阵与Illumina文库高度相似。将Nanopore文库所捕获的同源异构体信息与Illumina文库的表达丰度信息结合,可以对细胞类型进行更细致的分类和注释。

  为了验证FlsnRNA-seq方法的普适性,作者还对拟南芥的心形期胚乳进行了测序分析。通过细胞聚类和注释后,鉴定到了6个细胞簇,涵盖了前人报道过的所有胚乳细胞类型。此外,通过分析Nanopore数据发现,在以珠孔端胚乳为主的细胞簇中,mRNA的未剪接比例明显高于其它细胞类型,说明借助全长单细胞技术可以得到传统二代方法难以捕获的细胞基因转录和剪接信息。该方法极大拓展了植物单细胞RNA-seq的使用,从而使得植物中大规模地应用单细胞测序技术成为可能。

  翟继先教授为该论文的通讯作者,南科大为唯一通讯单位。翟继先课题组研究助理教授龙艳萍博士、博士生刘智剑和研究助理教授贾津布博士为该论文共同第一作者,南科大生科院陈炜教授和研究副教授方亮博士也合作参与了该研究工作。