发布时间:2021-10-14 00:34 原文链接: 前沿显微成像技术专题——转盘式共聚焦显微镜(2)

上一篇文章介绍了转盘式共聚焦显微镜的基本原理和技术特点,本篇主要介绍一些不同的转盘共聚焦系统。

常见转盘共聚焦系统

目前市场上最常见的是由日本Yokogawa(横河电机)公司生产的 CSU系列转盘系统,主流转盘共聚焦显微镜多使用的是这一系列。正如在前文中提到的,它由两个同轴排列的针孔圆盘组成,中间装有一个二向色镜。上方圆盘的针孔中装有菲涅尔微透镜 (Microlens disk),将光线聚焦通过下方针孔盘(pinhole disk)相对应的针孔,这些针孔位于微透镜的焦平面上(图1),这样经过微透镜聚焦的光再照射在样品上。同理来自样品的发射光经物镜再聚焦到针孔盘上,再由分色镜反射,经发射滤光片聚焦到相机上。因此来自一个针孔的照明光产生由同一个针孔收集的发射光。微透镜盘的使用能够显著增加透光量,提高图像信噪比;同时进一步减小了激光功率,降低光漂白,延长成像时间。

图1 Yokogawa 转盘系统原理示意 (from Zeiss Campus)

尼康转盘共聚焦显微系统使用的正是Yokogawa CSU系列,包括CSU-X1和CSU-W1(图2)。CSU-X1扫描速度高达10000转/分钟,理论上最大采集速度为2000帧/秒。CSU-W1的扫描速度较慢,最大采集速度为200帧/秒,但视场几乎比CSU-X1大4倍,可以使用更大视野的相机;还具有串扰低和近红外光谱范围更大的特点,能够对活细胞内部更深层区域进行清晰成像;并支持双相机,可以进行快速双色定位成像。CSU-W1有50μm和25μm两种尺寸的针孔,用于匹配不同倍数的物镜。25μm针孔可以搭配低倍物镜,视野更大,对比度更好。


在CSU-W1基础上推出的CSU-W1 SoRa模式使用60x和100x的高倍物镜,通过光学放大,微透镜技术和反卷积将横向分辨率进一步提升至120nm,实现转盘式共聚焦和超分辨显微成像的结合。

图2 Nikon CSU-W1转盘共聚焦显微成像系统 (配 Prime 95B)

奥林巴斯 IXplore SpinSR10 转盘共聚焦超分辨率成像系统(图3)使用的也是CSU-W1,并通过光学变倍达到缩小针孔的效果,提高系统分辨率。再结合奥林巴斯超分辨率(OSR)技术,可将分辨率进一步提升到120 nm。该系统可以对细胞内深达100微米的区域进行成像操作。光毒性低,稳定性好,可以迅速创建3D超分辨率图像数据,观察到活细胞内部的动态变化。

图3 奥林巴斯 IXplore SpinSR10 转盘共聚焦超分辨率成像系统

其他转盘共聚焦系统

微透镜固然好,不过一般价格也相对较高,微透镜的直径还会限制单位面积内的针孔数量,与不同显微镜制造商提供的物镜的数值孔径也不一定能够匹配。下面我们就介绍一些其他的转盘共聚焦系统,供大家参考~


意大利CrestOptics 公司的X-Light系列转盘系统(图4)采用单转盘设计,可以使用更为经济的LED光源,具有寿命长,能耗低,产热少的优点,对活细胞更加友好。该系统对针孔直径,阿基米德螺旋数和螺旋模式都进行了优化,提高了抑制杂散光的能力,可以在一定程度上实现更高的光通量,提高系统的分辨率和信噪比。转盘采用50μm针孔,并设计了Standard 和 Larger两种针孔间距,较大的间距能够降低串扰,适合厚样本切片。X-Light V3最大能够支持25mm对角线视野,方便大样本成像。

图4 两种针孔间距的 CrestOptics X-Light V3 转盘系统

另外还有一种非激光的共聚焦系统,来自Aurox公司的Aurox Clarity Laser Free Confocal(Aurox LFC,图6),将转盘和结构光照明相结合。激发光会通过一个反射罩(reflective mask)照射到样品上,反射罩上有一些由不同比率和空间频率的线组成的图案,以适应不同物镜。焦平面发射光主要来自受反射罩图案激发的区域,因此会通过反射罩,而来自其他非焦平面的发射光将被反射(图7)。因此我们会获得两张图像:一张通过转盘成像(WF+Confocal),带有结构图案;另一张通过转盘反射成像(WF- Confocal)。将两张图像相减,就能去除非焦平面的干扰信号。该系统具有宽场和共聚焦两种模式,光学切片能力与传统的点扫描式共聚焦相当。

图6 Aurox Clarity Laser Free Confocal

图7 Aurox LFC 光路示意。如白色箭头指示反射罩反射非焦平面的发射光,而来自焦平面的发射光可以直接通过反射罩

这种系统需要两个单独的相机成像,或在单个相机上同时成像,后者更容易进行校准和图像处理。因此,大视野的sCMOS相机更加适合。另外,由于两幅图在信号强度上差异很大,也需要大动态范围的sCMOS相机。

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