前沿显微成像技术专题——转盘式共聚焦显微镜（2）

发布时间：2021-10-14 00:34 原文链接：前沿显微成像技术专题——转盘式共聚焦显微镜（2）

上一篇文章介绍了转盘式共聚焦显微镜的基本原理和技术特点，本篇主要介绍一些不同的转盘共聚焦系统。

常见转盘共聚焦系统

目前市场上最常见的是由日本Yokogawa（横河电机）公司生产的 CSU系列转盘系统，主流转盘共聚焦显微镜多使用的是这一系列。正如在前文中提到的，它由两个同轴排列的针孔圆盘组成，中间装有一个二向色镜。上方圆盘的针孔中装有菲涅尔微透镜 (Microlens disk)，将光线聚焦通过下方针孔盘（pinhole disk）相对应的针孔，这些针孔位于微透镜的焦平面上（图1），这样经过微透镜聚焦的光再照射在样品上。同理来自样品的发射光经物镜再聚焦到针孔盘上，再由分色镜反射，经发射滤光片聚焦到相机上。因此来自一个针孔的照明光产生由同一个针孔收集的发射光。微透镜盘的使用能够显著增加透光量，提高图像信噪比；同时进一步减小了激光功率，降低光漂白，延长成像时间。

图1 Yokogawa 转盘系统原理示意 (from Zeiss Campus)

尼康转盘共聚焦显微系统使用的正是Yokogawa CSU系列，包括CSU-X1和CSU-W1（图2）。CSU-X1扫描速度高达10000转/分钟，理论上最大采集速度为2000帧/秒。CSU-W1的扫描速度较慢，最大采集速度为200帧/秒，但视场几乎比CSU-X1大4倍，可以使用更大视野的相机；还具有串扰低和近红外光谱范围更大的特点，能够对活细胞内部更深层区域进行清晰成像；并支持双相机，可以进行快速双色定位成像。CSU-W1有50μm和25μm两种尺寸的针孔，用于匹配不同倍数的物镜。25μm针孔可以搭配低倍物镜，视野更大，对比度更好。

在CSU-W1基础上推出的CSU-W1 SoRa模式使用60x和100x的高倍物镜，通过光学放大，微透镜技术和反卷积将横向分辨率进一步提升至120nm，实现转盘式共聚焦和超分辨显微成像的结合。

图2 Nikon CSU-W1转盘共聚焦显微成像系统（配 Prime 95B）

奥林巴斯 IXplore SpinSR10 转盘共聚焦超分辨率成像系统（图3）使用的也是CSU-W1，并通过光学变倍达到缩小针孔的效果，提高系统分辨率。再结合奥林巴斯超分辨率（OSR）技术，可将分辨率进一步提升到120 nm。该系统可以对细胞内深达100微米的区域进行成像操作。光毒性低，稳定性好，可以迅速创建3D超分辨率图像数据，观察到活细胞内部的动态变化。

图3 奥林巴斯 IXplore SpinSR10 转盘共聚焦超分辨率成像系统

其他转盘共聚焦系统

微透镜固然好，不过一般价格也相对较高，微透镜的直径还会限制单位面积内的针孔数量，与不同显微镜制造商提供的物镜的数值孔径也不一定能够匹配。下面我们就介绍一些其他的转盘共聚焦系统，供大家参考~

意大利CrestOptics 公司的X-Light系列转盘系统（图4）采用单转盘设计，可以使用更为经济的LED光源，具有寿命长，能耗低，产热少的优点，对活细胞更加友好。该系统对针孔直径，阿基米德螺旋数和螺旋模式都进行了优化，提高了抑制杂散光的能力，可以在一定程度上实现更高的光通量，提高系统的分辨率和信噪比。转盘采用50μm针孔，并设计了Standard 和 Larger两种针孔间距，较大的间距能够降低串扰，适合厚样本切片。X-Light V3最大能够支持25mm对角线视野，方便大样本成像。

图4 两种针孔间距的 CrestOptics X-Light V3 转盘系统

另外还有一种非激光的共聚焦系统，来自Aurox公司的Aurox Clarity Laser Free Confocal（Aurox LFC，图6），将转盘和结构光照明相结合。激发光会通过一个反射罩（reflective mask）照射到样品上，反射罩上有一些由不同比率和空间频率的线组成的图案，以适应不同物镜。焦平面发射光主要来自受反射罩图案激发的区域，因此会通过反射罩，而来自其他非焦平面的发射光将被反射（图7）。因此我们会获得两张图像：一张通过转盘成像（WF+Confocal），带有结构图案；另一张通过转盘反射成像（WF- Confocal）。将两张图像相减，就能去除非焦平面的干扰信号。该系统具有宽场和共聚焦两种模式，光学切片能力与传统的点扫描式共聚焦相当。

图6 Aurox Clarity Laser Free Confocal

图7 Aurox LFC 光路示意。如白色箭头指示反射罩反射非焦平面的发射光，而来自焦平面的发射光可以直接通过反射罩

这种系统需要两个单独的相机成像，或在单个相机上同时成像，后者更容易进行校准和图像处理。因此，大视野的sCMOS相机更加适合。另外，由于两幅图在信号强度上差异很大，也需要大动态范围的sCMOS相机。

转盘共聚焦的相机选择

说了这么多，到底如何选择最适合转盘式共聚焦显微镜的相机呢？其实我们不难从转盘系统的原理看出：由于透光率不高，相机灵敏度是首要考虑的参数。此外，高速和大视野的相机能够帮助转盘共聚焦系统达到最佳性能。这样一来，背照式sCMOS相机就是它的最佳选择啦！

为什么背照式 sCMOS 比 EMCCD 更加适合转盘？

首先，QE高达95%的背照式sCMOS具有与EMCCD相当的灵敏度。但是，EMCCD不但需要定期进行增益校准，同时由于电子倍增引入的额外噪声因素会降低总体信噪比，而像Prime 95B这样的sCMOS相机则不会遇到这些问题。
其次，背照式sCMOS在分辨率，速度，视野，动态范围等参数上都要优于EMCCD。常见的背照式sCMOS有6.5μm和11μm两种不同的像元尺寸，可以分别与60x和100x的物镜相匹配，达到最佳分辨率。而EMCCD像元较大，对样品细节的分辨能力较差。

我们可以看到，与EMCCD相比，Prime 95B的图像信噪比更高，并且可以对EMCCD看不到的样品细节进行更清晰的成像（图8）。