3.0版本的CRISPR，功能更强大

　　CRISPR-Cas9系统带来了基因组编辑的飞跃，大大提高了它的精度和效率。它能够快速实现一些人类疾病的建模，对生物医学研究产生了重大的影响。当然，CRISPR系统仍在不断发展。最近，Jackson Laboratory的Albert Cheng和Mark Wanner就介绍了它的最新进展。

　　CRISPR-Cas9最初只能实现剪切和粘贴的功能，就像早期的智能手机。之后，Cas9核酸酶升级到2.0版本，也就是核酸酶失活的Cas9（dCas9）。dCas9不再切割DNA，但仍然在向导RNA的作用下与基因组序列结合。这时，它就像更高级的智能手机。dCas9可与不同的效应蛋白结合，介导基因调控、编辑等功能。不过，CRISPR 2.0的不足之处在于它每次只能执行一种功能。

　　Casilio系统

　　尽管CRISPR 2.0已被证明对研究很有用，但基因不是独立运作的，研究基因网络和复杂疾病需要更强大的功能。如今，3.0版本CRISPR，即Casilio，应运而生。这是一个功能强大的平台，让CRISPR/Cas9可执行多个任务，轻松实现新的功能。它就像一部新款的智能手机，可同时运行多个应用程序，并不断安装新的程序。

　　Casilio是指CRISPR-dCas9和效应蛋白与可编程的Pumilio（PUF）RNA结合蛋白相融合。RUF结构域含有8序列重复，这些可以编程，改变两个特定的氨基酸残基，即可识别4种RNA碱基中的1种。有了Casilio，dCas9就好像一个夹钳，让gRNA定位到你感兴趣的基因组区域。利用单个dCas9和一个可扩展的Casilio模块（效应蛋白与PUF蛋白的融合蛋白）库，Casilio可实现多种功能。

　　Casilio所需的组件包括dCas9、至少一个sgRNA-PBS，以及Casilio模块。sgRNA-PBS作为带有一个或多个Pumilio结合位点的向导RNA，起了关键的作用。Addgene目前提供了多个模块，包括基因激活、基因抑制、染色体标记（荧光）、组蛋白乙酰转移酶模块等。

　　Casilio的应用

　　利用Casilio，研究人员能够通过单个向导RNA招募多个效应蛋白。在他们发表的文章中，Casilio能够多重利用PUF牵引着的效应蛋白，在多个位点同时实现精确的基因组操作。他们同时激活了OCT4，并抑制了SOX2。他们还证明了端粒和中心粒的双色标记。

　　另一个强大的应用就是蛋白复合物的组装。这让研究人员能够研究基因调控所涉及到的复合物。利用带有不同类型Pumilio结合位点的sgRNA，人们可以研究复合物中含有或不含特定组分的影响。也许还能研究化学计量对复合物功能的重要性，如招募x个组分A的分子 vs. y个组分B的分子。

　　目前Casilio表达载体只能用于瞬时转染，但研究人员也提供含有Casilio模块的Gateway供体质粒。这些可与Gateway兼容的其他载体共同使用。他们也在开发慢病毒表达载体，以便将Casilio导入其他类型的细胞