RNA 标准转录体系的一般回收率为 lugRNA/ug 质粒 DNA, 使用下面的方法，可以提高回收率至 5〜l0ug RNA/ug 质粒 DNA。大量制备 RNA 可以用于体外翻译。
| 实验材料 | 模板 DNA 或质粒 |
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| 试剂、试剂盒 | TETE 饱和酚氯仿异内醇3mol LNaAc无水乙醇5X 转录缓冲液lOOmmoL LDTTRNasinrATPrGTPrUTPrCTPSF6T3 或 T7RNA 聚合酶异戊醇DNase7.5mol L 乙酸铵无水乙醇乙醇 |
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| 实验步骤 | 一材料与设备
1) 模板 DNA 或质粒
2)TE
3)TE 饱和酚：氯仿
4) 氯仿：异内醇 (24:1)
5)3mol/LNaAc(pH5.2)
6) 无水乙醇
7)5X 转录缓冲液：200 mmol/LTris-HCl(pH7.9),30 mmol/LMgCl2，10 mmol/L 亚精胺,50 mmol/LNaCl
8)lOOmmoL/LDTT
9)RNasin
10)rATP，rGTP,rUTP,rCTP，各 2.5 mmoI/L
11)SF6,T3 或 T7RNA 聚合酶
12)TE-饱和的酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1,PH4.5)
13)DNase
14)7.5mol/L 乙酸铵
15) 无水乙醇
16)70% 乙醇
二操作方法
1) 在室温条件下按顺序加入以下组分：
5X 转录缓冲液 2ul
DTT，100 mmol/L 10ul
RNasin100U
rATP,rGTPT,rCTP,rUTP(各 2.5 mmol/L) 20ul
线状模板 DNA(1〜2.5 mg/ml) 2ul
SP6,T3 或 T7RNA 聚合酶 40U
加无 RNA 酶的水至终体积为 l00ul
2) 于 37〜40℃ 反应 1 h
3) 按 RNA 标准转录反应所述的方法除去 DNA 模, 纯化 RNA 转录物。 |
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