实验概要
运用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。
实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(0~100μg/ml),蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量,所以是一种比较好的蛋白质定量法。
主要试剂
1. 牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml;
2. 考马斯亮蓝G-250:称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸100ml,最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月; 3. 90%乙醇;
4. 磷酸(85%,W/V)。
主要设备
分光光度计
10ml量筒1支
研体
10ml容量瓶1支
1ml刻度吸管3支
10ml具塞刻度试管14支
实验材料
可溶性蛋白质
实验步骤
1.
标准曲线的绘制 (1)0~100μg/ml标准曲线的制作
取6支试管,按表28-1数据配制0~100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml,分别放入10ml具塞试管中,加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂,盖塞,反转混合数次,放置2min后,在595nm下比色,绘制标准曲线。
表1 配制0~100μg/ml血清白蛋白液
管 号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) | 0 1.0 0 | 0.2 0.8 0.02 | 0.4 0.6 0.04 | 0.6 0.4 0.06 | 0.8 0.2 0.08 | 1.0 0 0.10 |
(2)0~1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管,按表28-2数据配制0~1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤(1)操作相同,绘出0~1000μg/ml的标准曲线。
表2 配制0~1000μg/ml血清蛋白血液
管 号 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
1000μg/ml牛血清白蛋白(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) | 0 1.0 0 | 0.2 0.8 0.2 | 0.4 0.6 0.4 | 0.6 0.4 0.6 | 0.8 0.2 0.8 | 1.0 0 1.0 |
2. 样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液0.1ml(样品提取见各酶活测定),放入具塞刻度试管中(设两个重复管),加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后在595nm下比色,记录吸光度值,通过标准曲线查得蛋白质含量。
3. 结果计算 样品蛋白质含量(mg/g鲜重)= (C*V/a)/W 式中 C-查标准曲线所得每管蛋白质含量(mg); V-提取液总体积(ml); a-测定所取提取液体积(ml); W-取样量(g)。
注意事项
1.大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。 2.蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速,在2min左右反应达到平衡;其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时,不可放置太长时间,否则将使测定结果偏低。
中国科学院上海药物研究所研究员黄河、柳红合作,研究设计合成了一种含有吡啶甲醛片段的可断裂分子探针2PCA-Probe,可实现对蛋白质N-端的深度富集检测。相关研究发表于《美国化学会志》。蛋白质水解是一......
2月29日,德国、波兰、法国与中国台湾组成的科研团队在学术期刊《细胞》发表成果,开发出能在几分钟之内预测蛋白质“糖衣”形态的新型计算方法,有助于进一步了解蛋白质在健康和疾病中的作用,帮助药物与疫苗研发......
叶绿体中的光合作用将光能转化为化学能,吸收二氧化碳,释放氧气,是地球生物圈的重要塑造者。叶绿体约在15亿年前通过蓝藻内共生进化而来。在进化过程中,叶绿体基因要么被废弃,要么逐渐转移到细胞核染色体中,导......
猴子有尾巴,而人类和猿类的尾巴却在进化中消失了,是什么在其中起了关键作用?《自然》28日发表的一篇论文,报道了人类和猿类演化掉尾巴的遗传学基础。灵长类动物尾部表型的系统发育树(Ma表示百万年前)。图片......
集约化养殖过程中,免疫应激普遍存在于断奶仔猪饲养环节,会导致仔猪肌肉蛋白质降解和生长阻滞,最终严重影响肥育阶段产肉率和肉品质,给养猪业带来巨大经济损失。因此,有效缓解仔猪免疫应激是当前养猪生产亟待解决......
美国匹兹堡大学医学院的研究人员发现,摄入过量的膳食蛋白质会增加动脉粥样硬化风险。研究结果发表在19日的《自然·新陈代谢》杂志上。该研究结合了小型人体试验、小鼠实验和培养皿中的细胞实验。结果显示,当膳食......
随着人工智能(AI)技术的不断突破和大型模型的层出不穷,AI受到了前所未有的关注。面对这一浪潮,人们不禁好奇:未来究竟会是什么样子?为了解答这一问题,《Nature》杂志发布了未来的一年里,将密切关注......
荷兰科学家研究认为,到2050年,用替代性蛋白质取代50%的动物产品,可以腾出足够的农业用地生产可再生能源(其能量相当于今天的燃煤发电),同时从大气中去除大量二氧化碳。相关研究近日发表于环境科学期刊《......
2024年1月22日,《自然》发布了2024年值得关注的七大技术——大片段DNA插入、人工智能设计蛋白质、脑机接口、细胞图谱、超高分辨率显微成像、3D打印纳米材料和DeepFake检测。七大技术中,生......
自动化平行毛细管电泳系统可简化蛋白质分析2024年1月17日,北京——安捷伦科技公司(纽约证交所:A)今日宣布在第23届PepTalk会议期间正式发布用于蛋白质分析的新型自动化平行毛细管电泳系统——A......