5分钟认识酶标仪：从ELISA走向多功能和细胞成像

　　免疫分析方法无处不在。比如，这阵子大家购买的抗原检测卡，就应用这一原理。到医院里医生开个单子，查肿瘤标志物，也是基于免疫检测技术，只不过使用的是几十上百万的酶免疫工作站。酶标仪是酶免疫工作站中的核心设备，随着酶免疫分析技术的出现诞生，主要解决少量样本的自动化快速测试问题。而酶标仪今日的发展已经不仅仅是“酶标”，它可以应用多种原理、大小分子都能测、还可配合成像开展各种细胞实验。本文带您快速了解酶标仪的前世今生，并介绍主流的中高端产品，希望在您下次入手酶标仪时有点帮助。

酶标仪的发展历程

　　酶标仪的前世今生

　　1966年，美国的Nakane和Pierce及法国的Avrameas和Uriel同时报道了以新的标记物——辣根过氧化酶（HRP）替代荧光素，定位组织中抗原的酶免疫组织化学技术（EIH）。1971年，Engvall和Perlmann在酶免疫组织化学的基础上，又发展出一种酶标固相免疫测定技术，即酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），成为继放射免疫分析技术、荧光免疫之后的第三大标记免疫分析技术。70年代中期，随着杂交瘤技术的发展，发明了单克隆抗体制备技术，将其应用于酶免疫测定中，提高了其灵敏度和特异性，使一步法双抗体夹心法等酶免疫测定方法相继出现。

　　酶免疫分析技术是将酶催化的放大作用与抗原、抗体特异性反应相结合的一种微量分析技术。酶标记抗体或抗原后，既不影响抗体或抗原的免疫反应特异性，也不改变酶本身的催化活性，在相应的反应底物参与下，标记的酶水解底物或显色，或使供氢体由无色的还原型转变为有色的氧化型，其有色产物可以通过肉眼、分光光度计或显微镜观察或测定。

　　酶标仪问世之初，是酶联免疫吸附试验ELISA的专用检测仪器。发展到如今，凡是与光信号相关的实验、需要高通量、需要节省试剂的实验，且可以转移到微孔板中的液体物质，都可以考虑使用微孔板检测仪（酶标仪）进行信号检测。因此，人们沿用早期“ELISA Plate Reader”的酶标仪俗称，其实现在已经突破了ELISA的范畴，更常用的英文名称是“Microplate Reader”，译为“微孔板读板机（仪）”。

　　早期的酶标仪本质是一台分光光度计，用比色法对96孔微孔板中微量体积液体的吸光值（Absorbances，Abs）进行检测。检测时，光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔板中的待测样本，一部分光被样本吸收，另一部分则透过样本照射到光电检测器上，光电检测器将不同待测样本的强弱不同的光信号转换成相应电信号，再经前置放大、对数放大、模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器和打印机显示结果。微处理机还通过控制电路控制机械驱动结构x和y方向的运动来移动微孔板，从而实现自动进样检测过程。其中，光吸收检测技术原理符合朗伯比尔定律。

　　图1 光吸收酶标仪的技术原理

　　酶标仪国内市场的初体验及产业亟需提升

　　国内市场最早是单孔检测的酶标仪，无论检测还是数据读出分析，都需要花费很长时间，无法体现ELISA作为一种筛查技术在速度方面的优势，但这样一台酶标仪，当时能卖几万元。赛默飞（Thermo Fisher）曾推出了一款MK3酶标仪，其在测值前可以通过震动微孔板混匀液体，一分钟内读出整块酶标板的OD（optical density，光密度或吸光度）值，检测结果稳定，灵敏度甚至可以达到pg级。MK3配套赛默飞的应用软件，经简单数据处理后，得到标准曲线和检测值。MK3酶标仪曾在我国体外诊断领域广泛使用，后来又进入食品安全检测领域，见证了我国免疫检测试剂的发展和壮大，在2015年后代之以FC型号，笔者专门找到这款经典酶标仪的图片（见图2）。伯乐 (BIO-RAD)酶标仪，很早就进入我国市场，更多应用于科研院校；帝肯(Tecan)酶标仪也属于较早进入中国市场的欧洲品牌。

图2 赛默飞经典款酶标仪MK3

　　本世纪初，国内一些企业开始研制酶标仪，试剂公司也专门委托仪器厂商生产，这些酶标仪在技术设计上难免都有MK3的痕迹，市场呈现出严重的同质化趋势，应用软件的性能因此成为判定酶标仪优劣的唯一指标。而试剂公司配套软件的差异性，致使试剂严重依赖酶标仪。以至于试剂公司的销售策略为客户免费提供酶标仪，靠销售试剂赚钱。

　　酶标仪发展到今天，可谓百花齐放、千帆竞发，一副繁荣昌盛的景象。虽然国产酶标仪相关核心技术及产品性能质量与国际先进水平还存在不小的差距，产业成熟度亟需大的提升，但我们也欣喜地发现国产酶标仪在全波长多功能等中高端市场崭露头角。目前，大多数国产酶标仪还局限于吸光度单一检测的酶标仪——检测灵敏度相对较低，检测动态范围窄，更多的应用于微孔板的酶免检测，难以满足目前对多模式、超微量以及细胞复杂状态的实验要求。期待未来国产酶标仪能发挥工匠精神，拓宽领域，实现跨越式发展。

　　标记的多样化与多功能酶标仪应运而生

　　标记物的多样化，是免疫技术的发展和进步的一个方面。免疫检测标记物由最初的放射同位素，发展为安全无污染的辣根过氧化物酶（HRP）和磷酸酯酶，并进一步扩展到荧光素、稀土元素（目前主要是Eu）、上转换等；底物溶液也对应的由酶催化下产生颜色效应的底物发展为产生光子或荧光信号，获得更加灵敏和稳定的信号和更宽的线性范围，并相应产生了更多检测模式。

　　多种检测模式整合在单台仪器上，多功能酶标仪就运用而生了，可实现对吸光度、时间分辨荧光（TRF)、化学发光（Lum)及非标记检测技术荧光偏振（FP) 、荧光强度(FI，FRET)等两种或多种模式的检测。此外，应用于分子互作的BRET/NANO-BIT（生物发光共振能量转移技术）、荧光共振能量转移技术（TR-FRET）和ALPHA等，近些年也被应用于多功能酶标仪中。而且多功能酶标仪不限于微孔板检测，还可内置比色皿插槽。因此，酶标仪目前已成为一个广义的定义。美谷、帝肯、赛默飞、安捷伦（BioTek）、珀金埃尔默、闪谱生物等都先后推出了多功能酶标仪。

　　微孔检测与成像技术的结合

　　随着人类对生命科学领域研究的重视，使得更多的检测技术和检测仪器向生命分析领域倾斜。荧光成像技术或共聚焦（Confocal）与微孔检测结合，为生命科学，尤其是细胞研究创造了技术平台。微孔板检测和成像技术的结合，为酶标仪赋予了活体成像、高内涵成像等新的复合功能。

酶标仪的分类与发展

　　酶标仪主要有两种分类方法，按照滤光（单色）方式的不同，可分为：滤光片式酶标仪、光栅式酶标仪，帝肯、美谷等厂家还推出了“滤片+光栅”模式酶标仪；按功能划分，可分为单功能酶标仪和多功能酶标仪。这两大类型的划分是存在一定的交叉性。另外根据通道的个数，可以将酶标仪分为单通道和多通道两种类型，单通道又有自动和手动两种之分。

　　按照滤光方式分类

　　滤光片式酶标仪内置滤光片，根据试验所需选择滤光片来获得不同的波长。光源发出的全波谱光经滤光片后，大部分被过滤，只剩下滤光片本身允许的波长通过。对ELISA来说，检测波长范围是400～750 nm（固定波长：405，450，490，630 nm）可见光范围，即可满足显色测定需求。“单波长”只使用对显色最大吸收的波长测定，目前基本已淘汰。“双波长”除了对最大吸收波长进行测定外，同时用对特异显色不敏感的波长进行校准，OD值为二者之差。选择什么波长主要根据底物溶液颜色和pH值，比如邻苯二胺OPD-过氧化氢H2O2或四甲基联苯胺TMB-H2O2最大吸收波长不同，前者为最大吸收波长为492 nm，后者为450 nm。对于多功能酶标仪来说，检测波长范围覆盖紫外区、可见光区、近红外等，需要5~6个滤光片。滤光片式酶标仪获得的波长都是固定的，不能获得任意所需波长，而且更换滤光片价格昂贵。

　　光栅式酶标仪虽然近些年才出现，但是发展迅猛，很快成为酶标仪的主流产品。它的工作原理是：光源发出的全波谱光，经过光栅上分布的一系列狭缝的分光，获得任意波长的光，波长连续可调，一般递增量为1nm。光栅式酶标仪使用方便灵活，可以通过软件操作选择光的波长，而且可以通过全波长扫描获得未知样品的吸收峰，达到非靶向物筛查的目的，与我国检验检测市场需求的方向一致，这在酶标仪技术进步中具有里程碑的意义，从而问世后很受研发人员的普遍欢迎。

图3 光栅型酶标仪的技术原理

　　按照功能分类

　　酶标仪可分为单功能和多功能酶标仪。单功能酶标仪主要包括光吸收酶标仪、荧光酶标仪、化学发光酶标仪等。

　　光吸收酶标仪是对可见或紫外吸光度的检测，即检测被样品吸收掉的光密度。早期的光吸收酶标仪可测定的OD值范围普遍在0～2.5之间，现已拓宽到3.5以上，这有助于提高精密度和线性。当特定波长的光通过微孔板的待测溶液后，光能被吸收。被吸收的光能与待测物浓度呈一定的比例，从而实现对待测物定性或定量的检测。光吸收检测技术成熟、成本低、操作简单，但是动态范围窄，灵敏度较低。一般可见光或紫外光采用钨灯及氘灯作为光源，而紫外/可见酶标仪可以将两种光源切换。

　　荧光酶标仪是用来检测荧光强度。通过激发光栅分光后特定波长的光照射到被荧光物质标定的样品上，并通过发射光栅后到达检测器。荧光酶标仪可以检测多种类型的荧光，但荧光素容易受到背景干扰，现在更多的使用稀土元素作为标记物。荧光检测灵敏度高，检测信号相对稳定。

　　化学发光是检测化学发光酶免疫的光子信号或来自生物化学反应中的自发光，可分为闪光型和辉光型两种类型。辉光型发光持久，稳定，能持续一段时间；闪光型发光时间短，变化快，稳定性不强，需要应用自动加样器才可以进行。化学发光酶标仪用单光子化学发光检测器 (PMT)计数，光子数与样品中目标分析物浓度呈一定比例关系。化学发光酶标仪灵敏度非常高，动力学范围广。

　　多功能酶标仪是以上两种或更多检测模块的集成，通常情况下至少可提供光吸收、荧光这两种最常见检测功能，而一些中高端多功能酶标仪还可支持化学发光、时间分辨荧光、荧光偏振、生物发光共振能量转移，甚至还可以支持“Western Blot”和“上转换发光”等检测。某些多用途高端型酶标仪支持标准1cm立式比色皿插槽，可进行荧光强度和化学发光检测。多功能酶标仪功能强大、使用范围广、避免了重复购买，所以成为了实验室的首选。

　　酶标仪常配套洗板机使用，融合多种洗涤功能对微孔板条进行洗涤，如振荡、涡流、底部冲洗、两点吸液、连续式冲洗等，并且冲洗压力、冲洗时间可根据需要来进行调节，此外有的还具有不同类型微孔形状的选择功能。

　　医学检测对自动化的要求更高，因此常用全自动酶免疫分析仪，可分为全自动、开放式、连续进样、流水线式多批次酶免疫分析系统，适用于各级血站和医院进行血清学指标的ELISA测定分析。全自动酶免分析仪包括全自动酶免疫分析一体机和由前处理（4-16通道全自动样本工作站）、后处理、机械手（酶标板传递系统）三部分组成的连体机，将加液、孵育、条码扫描、洗板、酶标集成在一套系统中。如果是流水线式全自动酶联免疫分析工作站，其测试速度可达2200个测试/小时，3台八通道加样机，6台洗板机同时在线。

酶标仪广阔的市场应用前景

　　酶标仪在医食环生领域的应用

　　酶标仪广泛地应用体外诊断、食品安全、环境科学、生命科学、生物制药等领域。无论大分子蛋白的指示标记物还是游离小分子的检测，酶标仪在体外诊断中作为一个筛查手段得到广泛应用，比如术前八项、甲功检测、激素检测等。食品或农产品安全是酶标仪广泛应用的另一个领域，包括农兽药残留、添加剂、真菌毒素、“瘦肉精”等的检测。无论医药行业标准还是国家标准，酶联免疫分析方法都作为方法之一被列入，为酶标仪的广泛使用提供了技术和标准的支撑。

　　图4 不同波长对应的检测物质

　　环境污染物检测也是免疫检测的一个内容，例如今年的新污染监测，主要监测土壤、水质和大气中的持久性有机污染物、内分泌干扰物、抗生素和微塑料，其中前三者都可以用免疫检测技术进行检测。当然了，对水体中的各种藻类、毒素的检测，免疫检测也是一个不错的选择。而在生命科学及生物制药领域，酶标仪主要应用于DNA，RNA及蛋白（抗体）定量检测及细胞活动的表征。

　　酶标仪市场规模及发展预期

　　根据Grand View预计，到2030年，全球酶标仪市场规模预计将达到8.092亿美元，从2023年到2030年的复合年增长率为7.59%；根据Fatpos Global预计，从2020年的5.424亿美元到2030年超过7.342亿美元，年复合年增长率为4.01%。据上述估算，酶标仪2022年的全球市场规模约为5.87亿美元；以中国市场规模占全球15%计算，中国酶标仪市场规模约为6亿人民币。

　　按照地域，酶标仪市场分为五个主要区域：北美、拉丁美洲、欧洲、亚太地区、中东和非洲。预计北美将主导酶标仪市场，其次是欧洲。北美市场的强劲增长可以归因于政府在医学研究和技术研究方面的资金投入、FDA对酶标仪产品的批准、以及生物制药公司对先进和快速分析技术需求的增加。酶标仪市场扩大的主要推手是食品市场和数量的增加；生命科学各个领域的研究活动的增加：如基因组和蛋白质组学研究和新药的发现、各种科研机构临床诊断数量的增加、慢性疾病以及传染病发病率及人口的增加。事实上，这些推动力是包括中国在内的很多国家酶标仪市场快速发展的主要因素。

盘点：酶标仪产品百花齐放

　　酶标仪全球范围内的核心生产厂商主要包括美谷、赛默飞、安捷伦（BioTek）、帝肯、珀金埃尔默、BMG等，国产品牌主要是闪谱生物、爱康生物等。本文列出了近年来推出的新款酶标仪和各主流品牌主推的酶标仪。

　　表1 酶标仪主要厂商及产品

　　美谷（MD）

　　Molecular Devices 始创于上世纪80年代美国硅谷，作为全球高通量仪器设备的优秀品牌，一直致力于为生命科学研究及药物研发提供先进的解决方案。其产品覆盖微孔板检测分析、高通量筛选、高内涵成像、高效克隆筛选等。

　　图5 SpectraMax Mini 多功能酶标仪

　　SpectraMax Mini 是 Molecular Devices 是一台紧凑型、高性价比的多功能微孔板读板机，两功能或三功能可选，方便用户端升级检测功能，具有全波长光吸收，滤光片模式下的荧光、化学发光检测，采用制冷型的 Auto-PMT 提高信噪比，NFC 滤光片自动识别便于快速检测设置，具有精确的温度调节功能，便于进行温度控制型实验，标配数据采集和分析软件SoftMax Pro 7，针对主流各种试剂检测进行了相应的优化，以至臻的品质满足您的需求。

　　此外，下表列出了美谷多功能酶标仪的型号和功能。

　　表2 美谷多功能酶标仪的型号和功能

　　安捷伦（BioTek）

　　2013 年，安捷伦BioTek 推出Cytation 3多模式细胞微孔板检测仪，率先开发了将微孔板检测与活细胞表型分析相结合的检测模式，图像信息为微孔板检测结果提供了更直观且细腻的佐证。该系统率先为多功能微孔板检测成像系统配置了完善的活细胞培养条件，此后的Cytation系列，更可实现活细胞长时间的动态监测。

　　Cytation 细胞成像多功能微孔板检测仪，创新性地将传统的微孔板检测与高通量全自动数字显微成像相结合，支持各种生物化学和成像应用的自动化工作流程，并提供将标准微孔板检测输出数据与通过成像收集的表型细胞信息进行相互验证的能力。之前，以细胞为模型进行生命科学或者基础医学研究，不同的数据层次需要借助不同的技术手段来实现，比如生化分析和分子检测需要酶标仪的检测功能，表型分析和表达定位需要借助细胞成像的分析方法。

　　图6 安捷伦BioTek Cytation 7 细胞成像多功能检测系统

　　2020年推出的Cytation 7 细胞成像多功能检测系统具有独特的ZL设计，它将数字化的正置和倒置显微成像技术与传统的多模式微孔板检测技术结合于一体，支持透射光成像模式和反射光成像模式，集高通量、自动化、多模式为一套系统中，全功能酶标检测模块采用第四代光栅技术，满足吸收光、荧光、发光检测需求，可调带宽功能可以兼顾不同荧光染料的灵敏度和特异性。Cytation 7进一步拓宽了Cytation系列产品在细胞成像领域的应用范围，为生命科学领域提供有力的研究工具。

图7 安捷伦BioTek Cytation C10 活细胞共聚焦成像分析系统

　　Cytation 将酶标仪的应用扩展到了细胞形态学分析。2021年推出的BioTek Cytation C10增加了可以实现活细胞检测的激光共聚焦平台，并且可以实现宽场成像和激光共聚焦同时成像功能，在一台仪器中可以实现成像和酶标定量检测。自主研制的转盘共聚焦模块更适合活细胞动态监测，可选两种转盘，保证更好的共焦性能，并且具有高端科学级相机可以保证成像效果。

　　图8 安捷伦BioTek LogPhase 600 全自动微生物监测仪

　　2020年推出的 BioTek LogPhase 600 全自动微生物监测仪，能够测量多达四个标准 96 孔微孔板中的微生物生长曲线。该微生物监测仪具有专门设计的可靠振荡和恒温控制，这对于细菌和酵母细胞的最佳生长极为重要。LogPhase 600 由软件应用程序控制，提供简单而强大的用户体验。该软件可控制监测仪采集数据，并对所有微孔板执行微生物分析。

　　图9 BioTek Synergy H1 多功能微孔板检测仪

　　BioTek Synergy H1 是一款模块化多功能微孔板检测仪，具有光栅系统和基于滤光片的光学系统。独特的 Hybrid 技术可为多种应用提供出色的灵敏度和灵活性。该模块化平台可以在实验室工作流程发生变化时进行升级，以扩展功能。Synergy H1 可提供连续的带宽可调光栅，用于荧光激发和发射波长的选择。与固定带宽的系统相比，Synergy H1 的荧光带宽可设置在 9 nm 到 50 nm 之间，步进为 1 nm，使用户可以全面优化检测仪设置，以获得出色的分析性能。

图10 BioTek Synergy Neo2 多功能微孔板检测仪

　　BioTek Synergy Neo2 多功能微孔板检测系统采用独特的 Hybrid 技术，具有独立的光路，确保在所有检测模式下均能获得出色的性能。配备带宽可调的四光栅系统，基于滤光片的高灵敏度光学模块，激光 TRF 和多达 4 个 PMT，可提供超快速测定。先进的环境控制技术，包括 CO2/O2 控制，温控至 70°C 和变速振荡，以支持活细胞分析。BioStack Neo 可提供无人值守的自动化功能、高通量和条形码标记的滤光片模块，可以简化工作流程和降低出错率。强大的 Gen5 软件提供了全面的微孔板检测仪控制、强大的数据分析功能和 LIMS 集成。

　　闪谱生物

　　闪谱生物全称是上海闪谱生物科技有限公司，成立于中国科学院上海生物工程中心，专注于光栅型全波长酶标仪的研发、生产与销售。闪谱生物的全波长酶标仪产品于2012年3月正式上市，打破了进口产品对全波长酶标仪的垄断。

　　图11 SuPerMax3500型多功能酶标仪

　　闪谱生物SuPerMax3500型多功能酶标仪，国内第一款双光学系统多功能酶标仪的顶配机型，可任意选择与组合光路，同时具有光栅型荧光与滤片型荧光系统。标配四光栅荧光分光系统，检测限极低，可进行光谱研究。适用于荧光、光吸收、化学发光测试，并具有多种拟合曲线进行分析；支持双荧光素酶、碱性磷酸酶、荧光素酶等方法，适用于蛋白质定量分析，支持紫外，NanoOrange，Bradford，Lowry等方法及蛋白酶与激酶、磷脂酶等酶类活性测试；可用于DNA/RNA分析，支持PicoGreen，RiboGreen方法；适用于细胞活性和细胞毒性测试；SuPerMax3500型多功能酶标仪可广泛应用于药物筛选、分子生物学、免疫学、细胞学、生物化学等多个领域，是高性能微孔板测读分析领域的国产品牌。

　　赛默飞

图12 Varioskan LUX多功能酶标仪

　　赛默飞Varioskan LUX 多功能酶标仪可提供多达五种测量技术，包括吸光度测定、荧光强度测定、化学发光测定、AlphaScreen 测定和时间分辨荧光测定，并设置自动化动态范围选择（根据信号强度调节最适的读数范围）和内置安全控制功能（可在潜在错误发生前提醒用户），可帮助用户缩短实验室工作时间并减少常见错误的功能。Varioskan LUX 多功能酶标仪是协助用户进行实验室科研的有力工具。 

　　帝肯

图13 Spark Cyto 全自动实时活细胞成像检测系统

　　 Spark Cyto 是一款具有荧光成像和细胞检测的多功能微孔板检测仪，为细胞学研究开启新潜能。通过活体细胞成像与行业领先的检测技术相结合，使用户获得能够前所未有的效率和独特的包含多指标参数的定性和定量数据集合。Cyto 仅需使用一张图像即可对96或384格式的微孔进行整孔成像，实现真正的整孔细胞群研究，没有平铺或失真，不会错过任何一个细胞。三个放大级别物镜和四个荧光通道，用于荧光和明场成像，为各种细胞学应用提供高质量的图像和数据分析。而且Spark Cyto能够实时控制实验，使用并行数据获取和分析，确保你离开实验室时细胞不会停止活动，所以能动态监控实验从而不会错失任何关键事件，为细胞学实验提供深度有意义的见解。

图14 Spark®多功能酶标仪

　　Spark的高速单光栅的创新设计，可在5秒内提供200-1000nm的吸收光谱，使用的阶跃尺寸仅为1nm，有效地消除了样品蒸发的风险。光谱记录以无与伦比的波长精度和再现性（<=0.3nm）进行，为每个样品生成一致的数据。这种速度、准确度和重现性的结合使Spark成为小体积核酸定量和纯度检测的首选仪器，保证DNA检测下限为<1 ng/μL。

　　图15 Infinite® 200 PRO酶标仪

　　Infinite 200 PRO是一款易于使用的光栅或滤光片型多功能微孔板检测仪，具有七个配置型号。可用于ELISA、核酸定量、双荧光素酶报告基因、HTRF®和荧光偏振等实验检测，设备可进行原机升级。其不仅功能上可以满足实验室的常规需求，预算成本上也可做到最大的节约。

　　珀金埃尔默

图16 VICTOR Nivo多模式读板仪

　　VICTOR Nivo多模式读板仪是一款配置齐全、高性能、基于高灵敏度滤光片设计的多模式系统。VICTOR Nivo ™ 多模式读板仪突破传统，将常用的检测模式置于小型化的台式系统内。可满足日常生物化学和细胞生物学检测，检测任何波长，且除光吸收外所有模式都具有顶读&底读功能。软件界面友好易学，可通过任何电脑或平板对仪器进行远程操作——多用户环境的理想选择。结合我们提供的检测及试剂方案，让您的实验可以尽快开展起来。

　　德国BMG LABTECH

　　图17 CLARIOstar Plus全功能多功能酶标仪

　　CLARIOsta