C3b致敏酵母菌凝集试验测定法

实验概要

酵母菌经煮沸后，酵母多糖粘固在菌壁表面，可激活并粘附血清中的C3b，形成C3b致敏酵母菌，它能与免疫复合物中IgG上的补体结合点结合，如再加抗IgG，即能使致敏的酵母菌凝集。

主要试剂

1. 生理盐水、鲜酵母块、小鼠血清、10%明胶液、CFD原液、抗IgG血清、凝聚IgG、正常IgG等。

2. 0.1%明胶缓冲液：CFD原液用双馏水稀释5倍，即成应用液，取其99ml加10%明胶悬液1ml，即为0.1%明胶缓冲液。

主要设备

10ml试管、10ml离心管、滴管、1ml吸管或定量加样器、输液滴管、5号针头、玻璃滤斗、定性滤纸、水平离心机、水浴箱等。

实验步骤

1. 1%酵母菌的制备：取市售鲜酵母少许，用生理盐水配制成约1%～2%，洗涤3次，恢复原体积，置沸水浴中30min，用定性滤纸过滤，除去酵母凝块(低倍镜观察如仍有凝块，应再过滤)。取分散酵母菌，用生理盐水洗涤2次，最后用GVB液洗1次(此次应置刻度离心管内洗)，2500 r/min离心15min，去上清液，用GVB液配成1%酵母菌悬液(相当于1×10⁸菌/ml浓度)。

2. 小鼠血清的分离：试验当天对小鼠剪眼球采血液，放37℃水浴15min，离心分离血清，供作补体用。

3. C3b致敏酵母菌使用液的制备：取1%酵母菌悬液少许，加等量小鼠血清混匀。置37℃水浴箱15min，用5～10ml GVB液洗1次，2500 r/min水平离心10min，去上清液即得C3b致敏酵母菌，用GVB液恢复原体积，菌数应为1×10⁸个菌/ml，再5倍稀释成2×10⁷个菌/ml的使用悬液。

4. 测定：取试管5支，第1管用定量加样器加GVB液0.7ml，第2管不加GVB液，第3管至第5管各加GVB液0.1ml。第1管为稀释管加被检血清0.1ml，混匀，取0.1ml移至第2管(浓度为1：8)，另取0.1ml移至第3管(浓度为1：16)，依次作对倍稀释，第5管混合后弃去0.1ml。然后用装配5号针头的输液滴管吸取C3b致敏酵母菌使用液，给2～5管各加5滴，充分混匀，放37℃水浴30min。取出后每管加GVB液5～7ml，混匀，2 000 r/min离心5min，弃去上清液，用滤纸吸干。加入用GVB液作1：20稀释的抗IgG抗体(效价1：80)0.1ml，充分混匀，放4℃冰箱2h后，取出轻轻摇匀，吸取悬液少许置玻片上，低倍镜下观察(光线不可过强)，每次试验设凝聚IgG阳性对照与GVB液阴性对照。

5. 结果判定

-酵母菌散在；

25%以下酵母菌凝集成小块；

25%～50%酵母菌凝集成中等大絮状凝块；

50%～75%酵母菌凝集成较大絮状凝块；

75%~100%酵母菌凝集成大絮状凝块。

若阴性对照管为阴性，测定管1∶8或以上出现＋＋，即可判定为阳性。