CDNA文库筛选
（一）λgt11 cDNA文库铺平板
宿主细菌制备
1．用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。
2．将过夜培养物以3000×g离心5min。
3．分别用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4; 高压灭菌）重悬细胞沉淀。
4．细胞悬液可用于4℃贮存至一周。
预制噬菌体悬液铺平板
以已知滴度（如，已知每ml噬菌体颗粒数）的cDNA文库或其他噬菌体悬液开始，用λ－dil稀释以达到所需每平板噬菌体数。每个90mm直径平皿5×103个噬菌体/100μl开始筛选。
铺平板
1．将所需数量的LB平板置42℃温箱预热。
2．LB顶层琼脂（每平板最少2.5ml）用微波炉熔化，然后置49℃水浴中。
3．为温箱内的每一个平板准备一个12ml带螺旋盖试管，于室温，放在合适的架子上。
4．用移液器每管加100μlλ－dil稀释的宿主细胞悬液。
5．每管加100μl稀释的噬菌体悬液与细菌于漩涡器上简短混合。
6．含细菌和噬菌体（感染混合物）的试管于37℃温育25min，然后室温放置。
7．用一支消毒的10ml玻璃移液管在本生灯火焰上稍稍预热，取2.5ml保存在49℃的熔化顶层琼脂加到一支含感染混合物的试管内。
8．立即在手掌之间滚动混合管内混合物，然后均匀地倒入一个预热的LB平板上。
9．倒好的平板于室温置水平面上直至顶层琼脂凝固（至少5min）。
10． 重复步骤7至9，直至所有的细菌和噬菌体混合物都铺平板。
11． 平板置42℃温箱（对λgt11）直至噬菌斑长出。
（二）杂交筛选——cDNA序列作为探针
1．如上述将文库铺平板，噬菌斑杂交实验用E.coli宿主菌株Y1088。
2．噬菌斑于42℃生长过夜。
3．从温箱取出平板，置4℃冷却至少1h。
4．膜剥离：首先，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上给准备影印的平板编号。其次，从平板的中央开始向边缘小心将滤膜铺在菌台上。当滤膜完全变湿后（颜色变灰），再等30s。同时，用针头在平板上标出滤膜的3个不对称位置。小心将滤膜从平板上剥离，接触面向上放在一张干净的Whatman 3MM滤纸上。在进行下一步骤之前，所有的平板重复步骤4。
5．将滤膜接触面向上漂浮在变性液（0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/L NaCl）中5min。
6．中和5min。
7．用2×SSC洗涤5min。
8．将滤膜放在一张新的Whatman 3MM滤纸上，用铅箔将滤膜和滤纸一起包住。
9．在真空炉中80℃烘烤2h。
10． 用6×SSC预先短暂地湿润滤膜，然后用预洗液（50 mmol/L Tris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1% SDS）于68℃预洗涤至少1h。用一个盘子放在水浴摇床上。
11． 将25张滤膜转移到一个装有50ml杂交液（5×SSPE；1×Denhardt’s液；100μg/ml cT-DNA；0.1％SDS）的贮存罐内（直径至少90mm），68℃预杂交2h。
12． 对于每ml杂交液，2倍的105至1×106cpm的双链探针经沸水浴变性10min后，迅速放冰上冷却。
13． 变性探针立即加到预杂交混合液中。
14． 在封口的贮存罐内于68℃杂交过夜，不断地晃动以防滤膜粘在一起。
15． 杂交结束后，滤膜用2×SSC，0.01％SDS于室温洗涤3次约1h。
16． 将潮湿（防止干燥）的硝酸纤维素滤膜放在一张硬纸或X光片上，用放射性墨水在针头标签上作标记。
17． 滤膜用塑料包装袋（如Saran）包住，然后加上增感屏在X光片上于－70℃曝光过夜。
（三）免疫筛选
制备Sepharose偶联细菌裂解液
1．各用一个E.coli温度敏感溶源菌株（BTA 282（λgt11amp3）或BNN 97）单菌落接种于2×7.5ml培养基并于32℃生长过夜。
2．过夜培养物用LB培养基稀释100倍，于32℃生长至OD600值为0.5。
3．于45℃温育15min诱导噬菌体表达。
4．培养物于39℃进一步培养约2h。
5．测定噬菌体含量以便收集，氯仿测定操作步骤：3滴氯仿加到1ml培养物测试样品中，混合物于37℃温育。另一份不加氯仿的培养物作为平行对照。温育5min后，测试样品与对照比较。如果添加氯仿的测试细胞悬液清澈透明，细菌完全被吸附，刚好开始裂解，此时已可收集培养物。
6．于4℃以4000×g离心10min收获细菌。
7．从开始的两份7.5ml培养物离心得到的细胞沉淀用冷的偶联缓冲液重悬并再次离心。
8．各用5ml冷的偶联缓冲液重悬细胞沉淀。
9．超声波处理细胞悬液，直到粘度增加至不再释放出核酸。
10． 将细菌裂解物偶联到预先制备好的溴化氰活化Sepharose 4B于4℃过夜。
11． 以3000×g离心5min回收偶联物。
12． 用偶联缓冲液重悬沉淀并再次离心。
13． 为了饱和溴化氰活化Sepharose的未结合反应基团，沉淀物用冷（4℃）的饱和缓冲液重悬并在旋转轮上于4℃温育1h。
14． 通过三次连续的洗涤除去未吸附蛋白质，开始用洗涤缓冲液（pH4.0）；然后转换至pH8.0；最后一次洗涤pH为4.0，在这个处理前后和每次洗涤之间，在4℃，2500×g离心5min，收集材料。
15． Sepharose偶联细菌裂解液可以PBS悬液（＋0.01％硫柳贡）于4℃贮存几个星期。
用于筛选的抗体预吸附
1．浓度为0.5至1 mg/ml未稀释的第一抗体和第二抗体（如过氧化物酶偶联羊抗兔抗体，Calbiochem公司）分别用1.7倍体积的Sepharose偶联细菌裂解液混合，并在旋转轮子上于4℃温育过夜。每次筛选循环约需要300μl已处理的第一抗体（最终工作稀释度为1：100）和15μl已处理的第二抗体（最终工作稀释度为1：2000）。
2．悬液加到少量玻璃棉填充的加样器吸头内。未封闭抗体用冷冻封闭液（至少5倍于柱体积）洗脱。
3．用冷的封闭液调节洗脱出的抗体浓度至原先浓度的1/20。加入硫柳汞（终浓度0.01％）。
铺平板
1．如上所述铺制平板，作如下修改：
a. 另外一支含2.5ml顶层琼脂的12ml带螺旋盖试管置49℃水浴中以铺制诱导对照平板。
b. 在一份感染混合物中，用100μl噬菌体悬液含已知百分比的具有完整β-半乳糖苷酶基因的野生型噬菌体作为诱导对照。
c. 在加相应感染混合物前，为铺制诱导对照平板20μl X-gal立即加到2.5ml顶层琼脂中。