Cell子刊综述：多能干细胞的基因组编辑

　　具有敲除或突变等位基因的人类多能干细胞（hPSCs），可以通过定制设计的核酸酶产生。转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas9核酸酶，是编辑hPSC基因组最常用的技术。 1月6日，Cell子刊《Cell Stem Cell》在线发表了来自哈佛大学和麻省总医院研究人员的一篇综述文章，题为“Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions”。在这篇综述文章中，研究人员简单回顾了定制设计的核酸酶在hPSCs基因编辑中的应用，集中关注TALENs和 CRISPR/Cas9的实际应用。突出了每种方法的优缺点，并讨论了实验设计的理论和技术方面的考虑。

　　人类胚胎干细胞（hESCs）的分离和人类诱导多能干细胞（hiPSC）重编程的 发现，使干细胞生物学、体外疾病模型和药物发现重新复兴起来。在一般情况下，基于hPSC的疾病模型非常适合于研究遗传变异。例如，研究通常将病人来源的 hiPSCs——携带有导致疾病的基因突变，与（年龄相仿的）对照组衍生hiPSCs进行比较——通常分化为受影响的细胞类型，如神经细胞或肝细胞。这种 疾病建模策略需要注意，分化的倾向和表型特性的可变性，即使在来自同一供体的hPSCs中。

　　不过，即使一个给定突变的细胞表型是强大的、高度渗透的，也可能由于无关hPSC细胞系遗传背景中差异的混淆影响，而发生缺失。为了克服这一障碍， 一种非常强大的方法是，使用定制设计的核酸内切酶，使研究人员能够对内源性hPSC基因组序列进行精确和可编程的修饰。这种基因组工程战略，对于研究人类 生物学和疾病将是非常有价值的。

　　传递到细胞内之后，定制设计的核酸酶将特定的双链断裂（DSBs）引入DNA，可通过易出错的非同源末端连接（NHEJ） 或精确的同源指导修复（HDR），而得以修复。通过NHEJ的DSB修复，通常会导致靶位点中小的插入/缺失（indel）。这些缺失可造成移码突变，从 而导致蛋白编码基因的功能性敲除。双链DSBs将通过NHEJ修复，从而删除完全插入的序列。精确的遗传修饰（如核苷酸替换或删除）是由外源DNA供体模 板的共同传递完成的。

　　大多数的工程核酸酶包括一个可定制的、序列特异性的DNA结合结构域，与一段非特异性的DNA核酸内切酶结构域熔合。虽然自然发生的归巢核酸内切酶或大范围核酸酶已被成功用于基因组工程，但是它们在hPSCs基因组编辑中的应用，一直都是非常有限的。成功用于hPSCs基因组编辑的第一个定制设计、位点特异性内切酶，是锌指核酸酶（ZFNs）。ZFNs的设计相对比较困难，它们的设计以及在实验室中的构建，在技术上仍然具有挑战性。

　　另一个定制设计的核酸内切酶是TALEN。像ZENs一样，TALENs包括一段定制的TALE DNA结合结构域，与非特异性的Fokl核酸酶结构域熔合。TALEN介导的hPSCs基因组编辑，已被用于产生hPSC基因报告细胞系、基因的双等位基 因敲除以及点突变的修复和引入。

　　Cas9系统包含Cas9核酸酶和短的非编码CRISPR RNA序列，称为sgRNA。这些sgRNAs包含一段定制的20核苷酸序列，将共表达的Cas9核酸酶引导到sgRNA靶序列上，用以产生位点特异性的DSB。

　　在这项综述中，作者讨论了TALEN-和CRISPR/Cas9介导的基因组编辑程序用于hPSCs基因组编辑中，并可遵循一个通用的工作流程，并 强调了所存在的问题、未预料到的困难和与之对应的解决方案。这篇综述文章中所描述的许多基因编辑方法，已经在其他类型的细胞中得以验证，但是只要有可能， 就可以将它们应用于hPSCs。