Cell：科学家利用新方法鉴定肿瘤免疫治疗新靶点

　　2017年5月，《Cell》杂志连续刊登了美国西奈山伊坎医学院研究人员的工作，他们分离了来自肺癌病人肿瘤组织、正常肺组织以及外周血的免疫细胞，利用TCR测序和质谱流式（CyTOF）等技术对细胞特定转录本和表面30多个蛋白Marker进行检测分析，绘制了早期肺腺癌肿瘤微环境中免疫细胞的详细图谱。根据测序比对和质谱流式的分析结果，发现早期的肿瘤就已经开始在改变其微环境中的免疫细胞组成和表型了，尤其是T细胞、天然杀伤细胞和肿瘤浸润髓系细胞（TIM）。

　　数据结果

　　作者利用Phenogragh（一种以Unsupervised方式进行细胞分群的生物信息学分析工具），将T细胞（CD3+ cells）分为21个具有不同表面marker表达模式的亚群 ：

　　通过对这些亚群各个Marker的表达情况我们可以得知，其中有的亚群对应于我们已知的一些T细胞亚群，例如亚群I是CD4+ Th1 CM，亚群VI是Treg，但还有一些以前传统手段未识别出来的新亚群（例如亚群IX、XX等）。

　　通过对比这些亚群在不同样本中的比例，作者发现亚群VI（Treg）、亚群V（CD4+PD1+T）等多个亚群特异的出现在肿瘤组织中，提示这些亚群与肿瘤的发生过程有着密切的联系。

　　作者接下来进一步研究了肿瘤组织中靶向分子PD-1与不同T细胞亚群间的关系。数据显示PD-1仅在肿瘤组织CD4+和CD8+细胞中显著表达；通过ImmunoSEQ方法对细胞样本TCRbeta链的CDR3区域进行测序，分析发现虽然在肿瘤组织和正常肺组织中总体的TCR克隆型并无明显差异，但是在肿瘤组织中TCR克隆的形成和扩增明显和CD8+PD-1+ T细胞亚群特异性相关，且多发于TLS富集的肿瘤病灶区域，该现象在正常肺组织中并未观察到。

　　同样，作者用类似的方法分析了CD3 -细胞，将B细胞和髓系细胞精细的分为了20个亚群，通过对比这些亚群出现在不同组织的比例，作者发现了在肿瘤组织和正常肺组织内免疫细胞亚群构成和功能的巨大差异。例如，DC细胞（也成树突状细胞）在诱导肿瘤免疫的过程中发挥了重要的抗原递呈作用。在这项研究里，这类细胞被分为两个表型不同的亚群：CD141+DC和CD1c+DC，转录组数据表明两群细胞具有不同的活性，相比之下，除了细胞表面的一些重要的免疫功能相关受体有表达有差别外，前者的溶酶体相关基因具有更高表达水平。经过统计，作者发现CD141+DC在肿瘤组织中的比例显著低于正常肺组织，而CD1c+DC则差异不大。

　　与T细胞的结果类似，DC细胞亚群和功能的变化也反映了肿瘤组织中免疫细胞功能的失调。后续的分析表明，类似的变化还出现在NK细胞、单核细胞（Monocyte）、巨噬细胞（Macrophage）等细胞类型。这些信息汇总起来，充分说明肺癌肿瘤免疫微环境的系统性改变。以往的研究，一般专注于T细胞功能的改变，这项研究是对已有肿瘤免疫理论的重要补充和细化。相应的，在肿瘤的免疫治疗领域，主要也还是以激活T细胞为主（例如CAR-T，各种免疫检查点类的抗体药物），如果能采取措施活化肿瘤组织浸润的髓系细胞加以配合，很有可能大幅提高免疫治疗的效果。

　　研究意义

　　尽管该研究尚未直接改变目前的癌症治疗方案，但来自Dana-Farber Cancer Institute的免疫学家W. Nicholas Haining教授指出，该研究的重要性绝不局限于具体的实验结果，而在于所拓展的研究方向——肿瘤微环境中免疫细胞组成对患者预后的指示性作用及对癌症治疗的指导意义。

　　“我们需要对数百名癌症患者、数十种肿瘤类型进行研究，达到对每个样本要能分析数千个免疫细胞的水平，”他说道：“这是我们为了解这背后的生物学机制所必须做的。”

　　如何对细胞亚群进行精确细分？

　　已有报道数据显示，目前仅以一到两种蛋白质的表达来推断T细胞或巨噬细胞状态的做法，很可能会遗漏掉重要的信息(ref2)。传统方法多用流式细胞分析技术对细胞进行亚群分析，然而由于方法学上的限制，目前在单一样本上很难进行数十种参数的同时检测。

肿瘤相关巨噬细胞（上）和T细胞（下）分型的蛋白标记物(ref2)

　　Fluidigm公司的质谱流式ZL技术，利用金属元素标签进行抗体标记，大量去除背景噪音对实验结果的影响，并有效避免了传统方法下检测信号间的交叉重叠，无需荧光补偿。利用Helios质谱流式细胞仪可对样本同时进行超过40 种参数的高效检测，不仅可用于常规样本检测，更可解决某些临床珍贵样本量少的问题；同时通过单样本多参数检测，可对数据结果进行全面综合分析，避免了“盲人摸象”现象的产生。

　　另一方面，在T细胞研究中，TCRa、b链上的可变区域序列信息是分析T细胞克隆亚型的关键信息之一，其多变性和复杂性往往对T细胞分群和功能研究造成很大影响。区别于文章中所用的ImmunoSEQ方法仅针对群体细胞样本TCR的3’-end和CDR区域进行检测，Fluidigm公司与Sanger和EMBL-EBI等机构在单细胞水平合作开发了新的TCR序列分析方法——TraCeR(ref3)， 该方法通过C1系统制备单细胞全转录组后进行测序分析，数据不仅可以提供TCR全部可变区域序列信息，更可进行TCR全长序列分析，基于该分析结果能够准确、细致鉴别各种环境下的T细胞克隆亚型，对样本中复杂的T细胞群的表型和功能进行精确分析。该系统实现了从细胞捕获到核酸制备全部过程的自动化，可快速制备单细胞全转录组、全基因组及靶向序列的核酸样本。