采用 CytoFLEX 流式细胞仪上的紫光侧向散射光，有利于进行亚微颗粒分析和计数

背景和目标

基于 FCM 的纳米颗粒（SMP）检测需要特殊的散射光参数设置。该参数的设置和标准化可以用微球作为 QC 工具实现。

目标：采用流式细胞仪 (FCMr) 对 SMP 进行分析和计数。

● 采用微球对最有用的散射参数（FSC 或 SSC）进行测定

● 采用先前的标准化设置（1、2）对其标准化效果进行测试

● 对比蓝光和紫光 SSC 的散射灵敏度和分辨率

● 确认采用质控微球检测散射分辨率得到的增益值，是否会使检测细胞源微颗粒（MP ，亦称为 EV）具有较高灵敏度检测出现灵敏度增益值。

● 测试体积法绝对计数。

方法

质控微球：带荧光的大小校准过的聚苯乙烯珠混合物（1、2）。Mgx + FSC：100 nm – 300 nm – 500 nm – 900 nm 微球， 适用于以 FSC 触发检测微颗粒的 FCMr（例如，具有 W² 的 B.C.Gallios/Navios、Astrios、带 PMT-FSC 的 BD FACS-SORP、Influx）。

Mgx + SSC：160 nm – 200 nm – 240 nm - 500 nm 微 球，适用于以 SSC 触发检测微颗粒的 FCMr（其他荧光微球， 例如，B.D.FACS & LSR、Apogee A50、Stratedigm、MacsQuant、… 1）。

Gigamix = 两种 Mgx+ 的 v/v 混合物。其他荧光 75 nm 微球。

细胞源的微颗粒：无血小板血浆中的 PMP (CD41/AnnV)（正 常 供 体）；TF+ MP (SBTF1-PE/AnnV-F) & EPC-MP (CD59-PE/AnnV-F)，从 BxPC3 胰腺癌细胞和血管内皮祖细胞培养液中纯化并提取出来。

结果

1. CytoFLEX 采用 SSC 而非 FSC 标准化策略 (C & D vs G)

2. Violet SSC → 对微球 < 200 nm 和低背景噪声的分辨率率提高 (D)。vSSC 阈值较低，可以适用于低于 75 nm 的微球。（E、F）。

3. SSC 或 vSSC 使用阈值值为 170 nm 的 SSC 标准化设置 (G)，以及 FSC 使用阈值为 300 nm 的设置 (F) ，获得相似 PMP 计数。 CytoFLEX vSSC 截断值为 100 nm →PMP 计数值较高 (G)。

4. 降低 vSSC 阈值 → MP-TF 和 EPC-MP 计数高于实际标准（K、L）。

结论

1. Megamix-Plus 和 Gigamix 是非常有用的、评估新 FCMr 的质控工具。

2. 采用 CytoFLEX 时，可以通过 SSC 488 进行 SMP 分析， 但最佳方式是采用 SSC 405 (vSSC)。

3. VSSC 参数对 75nm 和 100nm 的微球分辨率很高。

4. 当 vSSC 阈值小于等于 100 nm 时，可对 MP 样品进行分析。

5. 较低 SSC 触发阈值 →更多 MP（参见各种类型）

采用体积法计数可以获取令人满意的数据（摘自摘要的新数据 #）

A) 散射光信号触发触发：FSC 或 SSC ？

采用两组 FCMr 进行 SMP 分析：有些使用 FSC 时表现最佳， 而其他一些则在使用 SSC 时分辨率更佳（有些则同时具备这两项优势，1）

相同 MP（例如，PMP 子集）位于 FSC 和 SSC 的不同位置。塑料微球是非常有用的质控工具，能够以可再现的方式设置 FCMr，但是无法提供 MP 的绝对大小信息（取决于折射率）。

B) SMP 仪器评估以及质控

1. 仪器是否在标准化条件下运行？

2. 哪一项为优选散射参数？
FSC 或 SSC ？→ 遵照右侧的组织结构图 (从 1 补充物料开始)。确认 FCMr 是否适合使用标准化条件后：

参考文献：

1.Poncelet P, Cytometry A, 2016 ; 89: 148-58.

2.Poncelet P, Transfusion & Apheresis Science, 2015, 53: 110-126.

C) 用蓝光对 CytoFLEX 进行初始质控

1. FITC 荧光信号触发触发 + Gigamix

2. → 蓝光 SSC 可以接受（非最佳）

3. → FSC 不可接受 (S.I. 500 –300 nm << 3.0)

4. 转至蓝光 SSC 触发，约 170 nm（标准）

5. 过滤后的水进样操作：约为 10,000 events/s，且可接受丢弃率约为 10%。

6. Violet-SSC → MP 分析灵敏度高于蓝色 SSC ？→

D) 用紫光对 CytoFLEX 进行二次质控

1. FITC 荧光信号触发触发 + Gigamix

2. → 紫光 SSC：300 nm 以下时，分辨率较高

3. 转至 vSSC 触发，约 170 nm（标准）

过滤后的水进样操作：< 10 events/s，丢弃率 < 1%。

E) CytoFLEX vSSC 可分辨 75 nm 微球

1. FITC 荧光通道信号触发触发 + Gigamix

2. 加入荧光 75 nm 微球

3. 75nm& 100 nm 微球间距较大

4. # 来自蓝光 SSC：75 nm ~ 100 nm。

5. 注意原始 1：数使用（B 从.C. Kaluza v1.5 重新处理获自 CytoFLEX

6. 注使意用 2：CytoFLEX 日常质控在 vSSC 设置中不适用！→ Gigamix 进行 SMP 应用的质控操作。

F) CytoFLEX vSSC → 触 发<75 nm-eq.

1. vSSC 触发 & Gigamix + 75nm µS

2. 阈值低于 75nm 微球

3. 使用 H2O 作为样本时可接受背景噪声最大。

*)<20k events/s，与约为 50k/s 的电子处理量进行对比。

4. 在 vSSC（峰值 < 75 nm）中的背景噪声事件率要比蓝光 SSC（峰值约为 100 nm）的低很多。

5. 75nm 与 100 nm 微球之间峰距宽 → 高分辨率。

6. 低于 170 nm 的标准化策略有待创建