DNA双链断裂检测——变压场凝胶电泳（GFGE）

DNA双链断裂与细胞死亡的关系更为密切。变压场凝胶电泳是采用将细胞包埋在低熔点琼脂糖凝胶中，通过蛋白酶、去污剂等渗入凝胶中融解细胞、去蛋白，纯化细胞DNA，再通过梯增电压进行琼脂糖凝胶电泳，结合DNA解旋荧光测定（FADU）法和检测DNA双链断裂。

1、主要试剂及配制方法：
（1）蛋白酶K，SDS，低熔点琼脂糖。
（2）配制方法：
细胞缓冲液（A液）。0.25mol/L NaCl + 10mmol Na2HPO4 + 1mmol/L MgCl2，pH7.2.
细胞裂解液（B液）。9mol/L脲 + 10mmol/L NaOH + 2.5mmol/L环烷二胺四乙酸 + 0.1%SDS。
碱性变性液I（C液）。B液 + 0.2mol/NaOH，体积比为45：55.
碱性变性液I（D液）。B液 + 0.2mol/NaOH，体积比为40：60.
抗变性液（F液）。1ug/L溴化乙锭 + 13.3mmol/NaOH.

2、实验操作步骤：

（1）DNA双链断裂的FADU测定：
分别取对照组和处理过的细胞2 x 10^5个加入试管内，对照管设T管（未变形）、B管(空白)、P管（部分变性）3组，处理过的细胞仅设Pi组，每组3个平行样品，，各加0.2ml细胞裂解液，0℃裂解细胞10min。
细胞裂解后，T管加E液（抗变性液）0.4ml，其他各管沿管壁缓慢加入0.1mlC液和0.1mlD液，不混匀，置0℃避光30min。
B管超声处理20s置15℃ 45min。
降为0℃后，P管、B管加E液0.4ml，混匀后T管、P管超声处理5s。
各加入F液1ml，混匀后，室温下用荧光分光光度计测量相对荧光强度（激发光520nm，发射光590nm）。
结果计算。

（2）DNA双链断裂的GVGE测定：
细胞DAN准备。收集细胞，用PBS洗涤并悬浮，调整细胞浓度为1 x 10^7个/ml，与等体积1.2%低熔点琼脂糖混合后制成小块，细胞胶块悬于含有不同浓度处理因素的培养基中，37℃孵育15-30min后将细胞胶块置于2mg/ml蛋白酶K、1%SDS、0.5mol/LEDTA、10mmol/L Tris-HCl的裂解液中，50℃，24h，融解细胞，去蛋白。然后用TE缓冲液清洗胶块，置于0.5mol/L EDTA中4℃保存待电泳。
电泳。电泳凝胶为0.9%琼脂糖，胶块大小10cm x 11.5cm x 1cm。取上述制备的DNA样品胶块放入电泳凝胶的加样孔中，用0.9%琼脂糖封固以防气泡，置于含45mmol/ Tris-硼酸、1.25mmol/L EDTA，pH8.0的电泳缓冲液中，逐渐升高电压，0.6V/cm x 40h，1.5V/cm X 7h，3.0V/cm x 2.5h，电泳完毕，取出凝胶。
照相图像分析。将上述凝胶在紫外灯下照射，同时，凝胶块用图像仪进行分析，显示样品DNA进胶盒残留在原点的分布状况，浸入凝胶的DNA即为双链断裂DNA。