DNA提取纯化技术概述

质粒DNA的提取与纯化

质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1 kb至200 kb以上不等。通常情况下，质粒可持续稳定地处于染色体外的游离状态，具有自主复制功能；但在一定条件下也会可逆地整合到宿主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为核酸克隆和测序最常用的载体。质粒DNA提取的产量和纯度直接关系到下游实验操作的成败。提取质粒DNA的方法很多，目前应用最为广泛的是碱裂解－中和法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性；当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时保留在上清液中；蛋白质与染色体DNA不能复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

质粒DNA的纯化方法通常是利用了质粒DNA相对较小以及共价闭环这两个性质，例如氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法。但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤即可去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA可满足酶切、转化、探针标记、测序等要求。然而该方法耗时较长，需要接触苯酚、氯仿等有毒溶剂，而且所提取的质粒 DNA有时不能被限制性内切酶完全消化，因此在追求效率的今天，这种方法已逐渐被质量可靠、快捷便利的离心吸附柱纯化方法所代替。

线性DNA片段的纯化

PCR产物或酶促反应的DNA片段中所含的酶、盐类、残留引物、dNTP和其他DNA片段有可能影响后续反应的效果，故需经过纯化处理。 对于电泳检测观察到的单一条带，可以采用乙醇沉淀回收或单纯过柱回收方法；对于有非特异性条带或其他杂带的DNA片段，则有必要进行胶回收纯化。目前商品化的DNA片段回收试剂盒多采用硅胶基质材料特异性地吸附DNA，通过高盐/乙醇洗脱，清除杂质。由于各种试剂盒所采用的硅胶基质材料不同，DNA片段的回收效率也存在着很大的差异。

基因组DNA的提取、纯化

基因组DNA相对稳定，故其提取方法也相对简单。通常细胞通过表面活性剂处理，释放出基因组DNA，经过蛋白酶和RNA酶消化后，经有机溶剂抽提和乙醇沉淀或过柱纯化即可获得一定量的基因组DNA。目前商品化的基因组DNA提取试剂盒分为溶液型和离心吸附柱型两种。溶液型产品价格经济，产率高，可获取适用于建立文库的高分子量DNA，并且可尽可能地回收稀有样品中的DNA；但操作过程较为繁琐，对操作者的实验技能要求较高。离心吸附柱型产品使用方便、快速，提取的DNA 纯度较高，但价格昂贵，产量偏低，并且得到的片段多在20 kb左右，不适合建立DNA文库或用作长片段PCR产物的模板。