DNA测序——鸟枪法

"鸟枪法"是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。

这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为鸟枪法或散弹枪实验法。

一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA，并用Agarose凝胶电泳进行回收。
 

二、对回收的大片段DNA用物理方法（如超声波等）进行切断处理，然后用T4DNAPolymerase对小片段DNA进行末端平滑化。
 

三、进行Agarose电泳，切胶回收1kbp～2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。
 

四、把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。
 

五、对阳性克隆（含1kbp～2kbpInsert）进行DNA测序。
 

六、对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。

一、DNA测序量

应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的6-8倍量进行计算（针对实际片段大小确定测多少倍的覆盖率），对每个反应的有效测序长度定义为600Bases。

如：对100kbp的DNA片段进行测序时，可以按以下方法进行计算：

6倍测序量＝100 000 Bases x6/600 Bases＝1 000个反应

8倍测序量＝100 000 Bases x8/600 Bases＝1 333个反应

二、结果编辑

按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序，然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段（Contig）。

三、补缺工作

结果编辑工作结束后，会发现在数个DNA大片段（Contig）间的序列没有测定，此时应该通过primer walking来测序，进行整体DNA序列的补缺工作。