DNA测序基本原理及流程

DNA测序基本原理及流程

1977年，Sanger等人发展建立起来的一种DNA测序方法。

基本原理：

双脱氧链末端终止法

双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似于正常dNTP的2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，将延伸的DNA链特异性地终止。其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分四组，每组按一定比例加入一种 (ddNTP)，它能随机渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸，可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列。

双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的优点，而且更适用于大规模的测序。但它要求有一个纯净的单链DNA模板和一个合成反应所需的特异性的引物。因此，早期的工作仅局限于单链噬菌体为模板，若干个不同的特定限制性内切酶酶解片段为引物，在模板链的不同部位引导合成，从而确定出噬菌体DNA的核酸序列。然而，对于大量存在着的天然双链DNA分子，因没有良好的制备产量和质量高的分离链的技术，而限制了双脱氧链末端终止法的应用程度。

经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进

标记物方面的改进： 由于放射性同位素对人体的危害，许多实验室开始利用非放射性物质来取代放射性同位素。如生物素、地高辛、银染法、荧光标记物等化学发光物生物素、地高辛、银染法、荧光标记物等化学发光物 。在双脱氧法测序时，它们作为标记物，示踪测序反应的产物，最后通过酶显色反应或者荧光信号显示出测序的结果。这些方法比传统的放射性同位素方法检测容易、安全、快速、费用也低。

经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进

电泳方法的改进 : 电泳方法的改进主要采用毛细管电泳法。 毛细管电泳是被分离物质在毛细管中的电泳。1992年，Matnies等首先提出陈列毛细管电泳法，采用激光聚焦荧光扫描检测装置。25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5小时内可读出350bp。DNA序列分析效率可达6000bp/h。

测序过程: DNA Sequencing with GenomeLab TM

⒈分离纯化模板DNA

⒉DNA模板定量分析

⒊测序反应

⒋测序反应后纯化

⒌On-line变性

⒍毛细管电泳和检测

⒎数据分析

分离纯化模板DNA

⒈应用质粒提取试剂盒或者切胶纯化的方法得到相应的质粒模板或者PCR产物；

⒉将DNA储存在灭菌水里如ddH2O, 18.2MH2O超纯水；

注意：不要使用 DEPC 处理的水，水中不能有EDTA ，否则将抑制测序反应

⒊通过紫外分光光度计定量DNA模板，DNA模板的浓度应该> 0.1ug/ul；

⒋通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA模板的质量。

测序反应后纯化

去掉反应产物中的dNTP,ddNTP 和盐分

乙醇沉淀 ( 利用96 孔板离心机）

测序反应后纯化

纯化得到 DNA测序反应产物

DNA测序仪检测

荧光标记的DNA链按从小到大的顺序被毛细管电泳分离。

激光诱导的荧光终止剂被检测器识别，直接阅读DNA的核苷酸序列