DNA的测序技术2

一：仪器:
离心机,PCR仪,高压电泳仪, 测序槽 ,摇床 ,染色,脱色缸
易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

二：试剂：
测序反应试剂 ,硝酸银,硫代硫酸钠,碳酸钠,37％甲醛,冰乙酸，乙醇,硅化及反硅化试剂

固定/终止液：１０%冰乙酸

染色液：混合２g硝酸银，3ml 37%的甲醛于２l超纯水中

显影液：在２l超纯水中溶解60g碳酸钠，冷却至10-12℃，临用前再加入3ml 37%甲醛，400μl 硫代硫酸钠(10mg/ml)。现配现用。

三：操作

（一）：测序反应操作

1：标记4个0,5ml的微量离心管(G.A.T.C)，每管加入２μl相应的d/ddNTP混合物，盖上盖子，保存于４℃或冰浴备用。

2：另外准备离心管按下表分别加入各种试液

任意模板平端 克窿到PGEM载体多克窿位点区的DNA

５×测序缓冲液 ５μl ５×测序缓冲液 ５μl

模板DNA fmol-pmol PGEMDNA(4μg) 4μl

特异性引物(4.5pmol) 3.6ul pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6μl

加水到终体积 １６μl 加水到终体积 １６μl

３：在上述２的模板/引物混合物中加入1μl测序级Taq酶(5μ/μl)，用移液器抽吸几次混匀。

４：从上述３中吸取４μl分别加入１中准备好的四组d/ddNTP混合液的离心管中。

５：在台式离心机中离心，使各试剂混合并沉降于管底。

６：在每管中加入一滴矿物油。

７：PCR反应，具体参数如下

95℃预变性 ２min 95℃(变性) 45秒 42℃(退火) 45秒 70℃(延伸) 60秒 60循环 70℃(延伸) 10min（注意：反应参数随PCR仪不同、引物不同有较大变化）

８：PCR结束后，在每管中加入3μl DNA测序中止液(在加入中止液前，样品允许在４℃保存过夜)，在台式离心机中离心，以中止反应。样品于－２０℃保存。