限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,这类酶的发现和应用可以用于以DNA重组为基础的生物工程技术。
| 实验方法原理 | 酶切指采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。 |
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| 实验材料 | DNA片段 |
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| 试剂、试剂盒 | TE缓冲液 |
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| 仪器、耗材 | 离心机恒温水浴取液器电泳仪电泳槽紫外观测仪 |
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| 实验步骤 | 一、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ单酶切及双酶切
1. 取2支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入
A（μl）B（μl）灭菌水1313EcoR Ⅰ缓冲液20Hind Ⅲ缓冲液02λDNA （或质粒DNA ）44EcoR Ⅰ10Hind Ⅲ01总体积2020 2. 37℃保温1-4小时。
3. 保温结束后65-70℃10 min 灭活酶（如为热稳定性酶，则用氯仿抽提）。
4. 取2 μl 左右的反应液加入2 μl 电泳加样缓冲液，电泳。
二、EcoR Ⅰ、Hind III双酶切
1. 取一支干净、灭菌Eppendof管，按下表加入各种试剂
加入试剂体积（μl）灭菌水12MULT buffer2λDNA（或质粒DNA）4EcoR Ⅰ1Hind Ⅲ 1总体积20 2. 37℃保温1-2小时。
3. 保温结束后65-70℃10 min 灭活酶（如为热稳定性酶，则用氯仿抽提）。
4. 取2 μl 左右的反应液加入2 μl 电泳加样缓冲液，电泳。
收起 |
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| 注意事项 | 1. 样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒。
2. 加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀。
3. 反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水解0.2~1 ug 模板DNA时，应将体积控制在20~30 ul 内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10，因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总体积的1/10，则反应液中甘油浓度将大于5%，而此浓度将抑制内切酶活性。
4. 为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此时不得不增加反应体积；而一般为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。
收起 |
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| 其他 | 单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免活力损失。 |
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